细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定-20121201

喻娟娟生物化学与分子生物学教研室联系电话:[phone]Email:[e-mail]细胞核的分离纯化及RNA、DNA的定量测定实验六1.了解细胞核分离纯化的基本原理和方法2.掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法3.掌握离心机的使用一、细胞核的分离与纯化（上午）二、RNA的定量测定三、DNA的定量测定（下午）一、细胞核的分离与纯化DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。二、核酸的种类及其分布核酸核苷酸磷酸碱基戊糖•定糖法（戊糖的差异）三、核酸的鉴定浓HClHCCHCOCHOHC＋3H2OHCCHCOCHOHC+OHCH3HOβ－D－核糖糠醛糠醛3，5－二羟基甲苯绿色化合物RNAＯＨˉ水解β－D－核糖+Pi+A.G.C.UHCCHCOHCCH3OOHCCH3地衣酚法:CHOCCH2OHOHHCOHHCOHH（1）核糖核酸RNA的测定DNAＨ＋水解β－D－２－脱氧核糖+Pi+A.G.C.UCH2CHOHCHOHCH2OHCHO-H2O硫酸CH2CH2CCH2OHCHOONH脱氧核糖ω－羟基－γ－酮基戊醛蓝色化合物二苯胺法:（2）脱氧核糖核酸DNA的测定1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3mmol/LCaCl2）称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5％拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2）称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5％柠檬酸液溶解并稀释至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/LNaCl液。在0.2mol/LTris—HClpH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。4、1.5％拧檬酸5、0.9％NaCl6、0.02NNaOH7、离心机8、水浴箱9、常规玻璃仪器试剂与器材用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加入1.5％柠檬酸钠溶液4.5ml，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。（1）肝细胞匀浆的制备（2）分离细胞质和细胞核①将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保留待测定核酸时使用。②余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。③另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。④加入Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。⑤加5ml0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液9ml核悬液0.25mol/L0.88mol/L初步纯化的细胞核其它的亚细胞结构半个肝脏＋1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆单层纱布过滤1次滤液离心：3500r/min；15min上清液（保留！）沉淀加入0.25mol/L蔗糖柠檬酸溶液1ml核悬液沿壁缓铺于9ml0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：2000r/min；10min上清液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀上层液（弃去）沉淀纯化的细胞核5ml0.02mol/LNaOH溶解细胞核待测样品鉴定离心：2000r/min，10min细胞核的分离与纯化实验流程试剂（ml）12细胞质液1.0-细胞核液-1.01mol/LKOH1.01.02.显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:试剂（ml）12空白管细胞质RNA水解液1.0--细胞核RNA水解液-2.0-5％三氯醋酸1.02.03,5一二羟基甲苯液3.03.03.01.水解：取试管二支，编号，按下表操作：混合各管沸水浴(10min)冷却加入5%三氯醋酸(8ml)搅匀后离心2000r/min；5min上清液立即混合各管沸水浴(10min)冷却660nm比色测定二、RNA的定量测定试剂（ml）12细胞质液2.0-细胞核液-2.01mol/L过氯酸2.02.0试剂（ml）12空白管细胞质DNA水解液2.0--细胞核DNA水解液-2.0-0.5mol/L过氯酸2.0二苯胺试剂4.04.04.0混合各管冷却离心上清液立即混合各管冷却2000r/min;5min三、DNA的定量测定2.显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取试管二支，编号，按下表操作：沸水浴(10min)沸水浴(12min)595nm比色测定表1.RNA的定量结果试管编号1（细胞质液）2（细胞核液）原始吸光度值查标准曲线所得数值提取液中RNA浓度（ug/ml）RNA占总RNA的百分比提取液中RNA浓度（ug/ml）=显色反应试管中RNA含量×稀释倍数（细胞质液稀释倍数为10倍，细胞核液的稀释倍数为5倍）表2.DNA的定量结果试管编号1（细胞质液）2（细胞核液）原始吸光度值提取液中DNA浓度（ug/ml）DNA占总DNA的百分比1.酸性溶液，取用要小心。2.混匀要充分，并且要注意安全，防止液体溢出。3.沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全。4.离心完后，一定先将上清液转出到另一试管，再吸取所需量的水解液。3.除了定糖法来测定DNA和RNA的含量，还有已经学习过的哪种方法也可以用来测定DNA和RNA的含量？1.为什么说本实验的题目不合适？2.我们已经学习了电泳法来分离蛋白质，请问我们是否可以用这种方法来分离DNA、RNA？实验七氨基酸的薄层分析下次实验预习内容