第三代的纳米芯片测序技术

基因芯片对生物学研究进展的影响西北农林科技大学.干细胞研究中心西北农林科技大学.动物医学院对基础学科发展的影响•DNA测序：杂交测序（SBH）；•基因表达分析；•基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析；•基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达；•药物研究与开发。•食品卫生安全芯片技术用于基因序列测定•第一代的杂交测序；•第二代的合成测序-单/四核苷酸循环；•第三代的纳米芯片测序技术；传统的基因测序方法•测序时分成四个单独的反应，每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行聚合反应。在聚合反应过程中，ddNTP和dNTP会随机性的结合，一旦ddNTP加入了新合成的DNA链,由于其3位的羟基变成了氢,不能形成磷酸二酯键，所以不能继续延伸。由此产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。尿素变性的PAGE电泳胶杂交测序原理基因芯片的测序原理是杂交测序，即通过与一组已知序列的核苷酸探针进行杂交完成核苷酸序列测定。用图5-9说明测序原理。在一块基片表面固定已知序列的八核苷酸探针，当溶液中带有荧光标记的核苷酸序列TATGCAATCTAG与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补杂交时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核苷酸待测序列。DNA芯片测序技术包括芯片制备、样品制备、分子杂交、检测分析、序列分析和组装等过程。杂交测序原理示意图新一代的测序原理关键的技术点：1.核苷酸序列的接头技术；2.四种核苷酸的标记技术；3.接头与片基的结合技术；4.高通量的电脑分析技术；5.高效序列分析拼接软件；第一步，基因组被打断为100-200bps的片段每个片段被接上接头序列接头后的片段在片基上固定对应链的边合成边测序一个芯片上，1000，000点样，一次测定可以循环30次；耗时5个小时；从理论上讲，5个小时可以完成30,000,000个碱基的测序量;工作人员一天就可以完成60,000,000个碱基的测序量;从理论上讲,50个工作日就可以完成一个人的全基因基因测序任务。该方法的优势：1.高通量：一轮反应可产生大于1Gb的数据；2.快速：产生1Gb数据的时间约为3天；3.成本低廉：每测量100万个碱基对所需成本3美元；两代测序方法，测序序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的，除了需要昂贵的光学监测系统,还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加，依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用。新型纳米孔测序法（nanoporesequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。•2008年开始的第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。第三代测序技术的基本原理是在纳米孔中配置纳米电极，用电测方法测量一个DNA的核酸碱基排列。但是电测识别一个分子的技术开发极其困难，因此尚未有验证该原理的实例。•孔道蛋白：是金黄色葡萄球菌α溶血素；•纳米孔道的电位测量；基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述，表达谱芯片的应用进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。基因芯片的优点：1.高通量2.大规模3.高度平行性4.快速高效5.高灵敏度6.高度自动化组织芯片不同的癌组织芯片；病理组织切片；不同器官来源组织芯片；蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。蛋白芯片(proteinchip)研究蛋白质芯片的意义蛋白质是基因表达的最终产物，接近生命活动的物质层面；探针蛋白特异性高、亲和力强，可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。蛋白质检测芯片蛋白质功能芯片蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的制备•固相载体及其处理•载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）•蛋白质的预处理•选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解•点制微阵列•可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等固定微阵列上的蛋白样点膜为载体：芯片放入湿盒，37°C1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA或Gly蛋白质芯片检测探针标记检测法无探针标记检测法表面增强激光解吸离子化技术(Surfaceenhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)表面等离子体共振检测技术（surfaceplasmonresonance,SPR）原子力显微镜检测技术（atomicforcemicroscope,AFM）同位素标记检测荧光标记检测化学发光检测酶免疫标记检测胶体金标记检测蛋白质芯片的应用疾病诊断和预警药物开发蛋白质组学定量检测组织提取液中的肿瘤标记物孵育后的微阵列荧光图A含抗原B无抗原微阵列方法与ELISA方法检出结果比较疾病诊断uPA尿激酶型纤溶酶原激活因子PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子VEGF血管内皮生长因子高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂药物开发A1500个点阵的微阵列B局部点阵放大图及SPR信号His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图加入His6-RB加入含PepC抑制剂的His6-RB（1）疾病的蛋白质组研究通过比较正常与病理条件下细胞或组织中蛋白质在表达量上的差异，可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白。作为疾病诊断的生物标志物，认识发病机制，为早期诊断治疗和预防提供线索，对疾病进程进行监测与控制。对肿瘤特异性生物标志物的检测；在糖尿病及心血管疾病方面的应用；对类风湿性关节炎生物标志分子的检测；对人类细胞因子和趋化因子的测定和定量分析。蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用（2）病原微生物的蛋白质组研究病原微生物蛋白质组研究对于阐明感染性疾病的发病机制，实现有效的预防，早期诊断和治疗，制备新的药物等方面有着重要意义。（3）在药物开发中的应用在病理状态下表达异常或特异性表达的蛋白质，以及细胞信号传递通路中的关键性蛋白质，都可能成为药物设计的靶分子。（4）毒理学分析通过发生损伤的组织器官与正常组织器官之间的蛋白质组比较，有助于阐明药物毒副作用的发生机制。蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用人动脉平滑肌细胞蛋白谱蛋白质组学揭示了oxidizedlowdensitylipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式细胞经oxidizedlowdensitylipoprotein作用后的蛋白谱4.7%抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调；13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降存在的问题•成本过高，需一系列昂贵的尖端仪器•芯片的标准化问题•提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等染色质免疫沉淀芯片（Chip-Chip）ChiP-on-chip是染色体免疫共沉淀与芯片技术的结合，用于分析在活体细胞中调节蛋白与基因组DNA之间的相互作用。该技术能够快速在目标基因组的染色体中确定特异DNA结合蛋白的准确结合位点，ChIP芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的结构改变。一、ChIP-Chip的用途（1）在基因组范围内确定基因转录因子的DNA结合位点和其他DNA结合蛋白或蛋白复合体的DNA结合位点。（2）染色体活性状态的定量分析。（3）组蛋白修饰的功能研究。通过用酰基化或甲基化的组蛋白的特异抗体和没有进行修饰的组蛋白的特异抗体，可以确定与组蛋白修饰有关的结合模式的变化。（4）聚合酶活性的定量分析。（5）精炼生物信息方法，用功能数据来确定启动子的位置。交联与裂解细胞超声破碎免疫共沉淀测序得到序列信息与基因组信息比对•ChIP-on-chip技术能为一些重要机制的研究提供线索，包括DNA复制、修饰、修复，更重要的还有甲基化以及组蛋白修饰等等；还能帮助我们更好的理解一些疾病的发生机理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。除此之外，ChIP-on-chip技术也已在一些至关重要的生命过程中为我们提供了重要的线索，包括细胞增殖、细胞分化、癌症发生、细胞周期、细胞凋亡以及神经生成等过程。•研究基因启动子部位组蛋白的甲基化乙酰化或磷酸化水平改变；•研究基因启动子部位DNA甲基化水平改变•研究转录因子与其结合的所有基因启动子DNAGeneChip-TilingArray技术简介•Affymetrix公司于2006年1月24日宣布推出GeneChip（R）人类和鼠源嵌合芯片（TilingA，ray）系列产品。该系列芯片研究范围大大超出已知编码蛋白序列，可以对整个人类和小鼠基因组进行系统的研究•嵌合芯片（TilingArray）是迄今为止分辨率最高的基因芯片类型，其探针设计几乎涵盖了目标DNA的全部序列。迄今为止，Affymetrix公司已经开发出了人、小鼠、酵母、线虫、拟南芥等模式生物的全基因组Tiling芯片，为全基因组规模上研究目的蛋白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具。GeneChip-TilingArray除了全基因组芯片外，还包括了专门应用于ChIP—Chip技术中的人启动子和小鼠启动子两款芯片，探针设计覆盖了转录起始位点附近10kb的范围，可针对肿瘤相关的1300个基因，覆盖范围更是增加到了12.5kb。液态芯片原理•编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径5.6μm的聚苯乙烯微球（Beads）染成不同的荧光色，从而获得多达100种经荧光编码的微球。•交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。•检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、抗体或酶等，也可以是PCR产物）。悬液中的微球与被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。