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烟草青枯病黄俊斌教授刘海龙黎妍妍研究背景烟草是一种重要的经济作物，是烟区人民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草的病害发生严重，尤其是烟草青枯病，几乎分布于世界上所有烤烟种植区。烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起,1864年在印度尼西亚首先报道。该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。一、症状正常萎蔫典型症状是叶片萎蔫，部分叶片变黄，茎上出现长形黑褐色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。枯萎茎干变褐叶肉病变茎干变褐研究内容二、病原菌的分离和鉴定1.病原菌的分离采用稀释划线分离法。将烟草病株基部的茎杆表面用清水洗净晾干，75％的酒精表面消毒，在含有无菌水的培养皿中研磨病组织。用移菌环蘸取少量菌液在TTC培养基（青枯菌选择培养基）上划线，30℃培养48h。TTC平板培养48h后青枯菌菌株的菌落形态TTC培养基：NA培养基中加入三苯基四氮唑（TTC）.烟草青枯菌分离菌株来源菌株烟草品种地理来源菌株烟草品种地理来源XE1-1云烟87宣恩县晓关镇XF3-1毕纳1号咸丰县忠堡镇XE1-2云烟87宣恩县晓关镇XF3-2毕纳1号咸丰县忠堡镇XE2-1毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-1云烟87巴东县大支坪镇XE2-3毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-2云烟87巴东县大支坪镇XE2-4毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-3云烟87巴东县大支坪镇XE3-2云烟87宣恩县晓关镇RS1-4云烟87巴东县大支坪镇XE3-3云烟87宣恩县晓关镇RS2-1云烟87恩施市盛家坝乡XE3-4云烟87宣恩县晓关镇RS2-2云烟87恩施市盛家坝乡XE4-1云烟87宣恩县晓关镇RS3-2云烟87恩施市三岔乡XE4-2云烟87宣恩县晓关镇RS3-3云烟87恩施市三岔乡XE5-1云烟87宣恩县晓关镇RS4-1云烟87恩施市盛家坝乡XE5-2云烟87宣恩县晓关镇RS4-2云烟87恩施市盛家坝乡XE5-3云烟87宣恩县晓关镇RS6-1云烟87恩施市龙凤镇LC1-2云烟87利川市柏杨坝镇RS6-2云烟87恩施市龙凤镇LC1-4云烟87利川市柏杨坝镇RS6-3云烟87恩施市龙凤镇LC1-5云烟87利川市柏杨坝镇RS5-1云烟87来凤县旧司乡LC1-6云烟87利川市柏杨坝镇RS5-2云烟87来凤县旧司乡LC2-1云烟87利川市柏杨坝镇RS5-3云烟87来凤县旧司乡LC2-2云烟87利川市柏杨坝镇RS5-4云烟87来凤县旧司乡LC2-3云烟87利川市柏杨坝镇RS7-1云烟87鹤峰县燕子乡LC2-4云烟87利川市柏杨坝镇RS7-2云烟87鹤峰县燕子乡XF1-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-3云烟87鹤峰县燕子乡XF1-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-4云烟87鹤峰县燕子乡XF1-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-1鄂烟1号建始县高坪镇XF2-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-2鄂烟1号建始县高坪镇XF2-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-3鄂烟1号建始县高坪镇XF2-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-4鄂烟1号建始县高坪镇2病原菌的纯化和保存从TTC培养基上挑取呈不规则圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进行纯化，2-3次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌水中20℃保存。3青枯菌的分子鉴定通过常规PCR，利用青枯菌种的特异性引物759／760，对分离获得的菌株进行分子鉴定，根据扩增结果来确定是否为青枯菌。•引物序列：759：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG•PCR扩增采用25μL反应体系，其中10×PCRbuffer2.5μL，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200µM，引物759和760各1µL，DNA5µL。反应程序为：95℃2min；94℃20s，3068℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。3.青枯菌的分子鉴定结果扩增结果表明：所有分离获得的供试青枯菌菌株均可扩增得到280bp左右的特异性片段。分离菌株的特异性PCR鉴定结果注：1-22、24-46分离的烟草青枯菌；23：阴性对照；M：1000bpMarker（自上而下片段大小分别为：1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）280bp280bp280bp三、烟草青枯菌菌系分化研究1.青枯菌生理小种鉴定供试菌株：从湖北恩施地区烟草青枯病病株上分离的54个青枯菌菌株。鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒接种方法：1mL细菌悬浮液（浓度为108cfu／mL），注射到5-7叶期的寄主茎基部。培养条件：温度30℃，相对湿度80%以上。小种划分：接种7天后，调查接种植株的抗感反应，根据Budenhagen、华静月等人制定的生理小种划分标准，确定菌株的生理小种归属。青枯菌的生理小种划分标准小种侵染植物1号茄科植物（包括番茄、马铃薯、烟草、辣椒、茄子等）和其他科植物2号香蕉、大蕉和海里康（Heliconia）3号马铃薯和番茄、茄子（偶尔侵染）4号姜，番茄、马铃薯（致病力很微弱）5号桑（致病性很强）；番茄、马铃薯、茄子、龙葵和辣椒（致病力很微弱）烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主•鉴定结果表明：54个烟草青枯菌菌株接种6种鉴别寄主均能使其致病，发病率均为100%，侵染的植物种类范围符合生理小种1号的侵染范围，因此可将供试菌株划分为生理小种1号。2.烟草青枯菌生化型测定根据菌株对3种双糖（乳糖、麦芽糖、纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）的利用程度，将菌株划分为不同的生化型。测试项目生化型ⅠⅡⅢⅣⅤ甘露醇－－＋＋＋山梨醇－－＋＋－甜醇－－＋－－乳糖－＋＋－＋麦芽糖－＋＋－＋纤维二糖－＋＋－＋注：“+”代表能利用（培养基变黄），“－”代表不能利用（蓝色）青枯菌生化型划分标准根据何礼远、华静月等提出的青枯菌5型划分标准，对分离菌株进行生化型划分，标准如下：生化型测定结果表明：54个烟草青枯菌菌株均能利用3种双糖和3种己醇，根据青枯菌生化型划分标准鉴定均为生化型Ⅲ。甜醇山梨醇甘露醇纤维二糖乳糖麦芽糖菌株对3种己醇和3种双糖的利用（左为CK，右为接菌）3.烟草青枯菌演化型鉴定参照Fegan和Prior的方法，用7条引物扩增青枯菌株DNA，根据扩增的片段大小确定供试菌株的演化型。用于演化型鉴定的引物序列引物序列Sequence（5'-3'）扩增片段分类归属片段大小Nmult21:1FCGTTGATGAGGCGCGCAATTT演化型Ⅰ144bpNmult21:2FAAGTTATGGACGGTGGAAGTC演化型Ⅱ372bpNmult23:AFATTACSAGAGCAATCGAAAGATT演化型Ⅲ91bpNmult22:InFATTGCCAAGACGAGAGAAGTA演化型Ⅳ213bpNmult22:RRTCGCTTGACCCTATAACGAGTA-759GTCGCCGTCAACTCACTTTCC青枯菌种特异性280bp760GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-DNA提取：用TaKaRa试剂盒提取菌株的DNA。PCR扩增采用25μL反应体系，其中包括：10×PCRbuffer2.5μL，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200µM，引物759和760各4pmol，引物Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF，Nmult22:InF，Nmult22:RR各6pmol，DNA模板50ng。反应程序为：96℃5min；94℃15s，3059℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。取5μLPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5V／cm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。反应程序为：96℃5min；94℃15s，3059℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。取5μLPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5V／cm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。280bp144bp四、青枯菌的寄主范围•青枯菌的寄主范围非常广泛，可侵染包括54个科的450余种植物，如烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃薯、桑树、油橄榄、甘薯等。五、烟草青枯病田间发生动态研究调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田调查时间：2013年6-8月调查方法：采用双行平行跳跃法定点定株调查调查内容：发病时期，发病率，气候条件等。按照国家标准(GB/T23222-2008)，以株为单位分级调查，分级标准如下：0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑；3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2；5级：茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达茎顶部；7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部萎；9级：病株基本枯死。01020304050607080901006/16/86/156/226/297/67/137/207/278/38/108/178/24调查时间发病率（%）05101520253035404550病情指数发病率病情指数2013年咸丰点烟草青枯病发生情况始发期6月20日，发病率为3.33%，病情指数为0.37，随着日平均气温达到25℃，7月中旬进入盛发期，8月底发病率达到90%以上，病情指数达37以上。01020304050607080901006/16/86/156/226/297/67/137/207/278/38/10调查日期发病率（%）05101520253035404550病情指数发病率病情指数2013年宣恩点烟草青枯病发生情况始发期为6月8日，发病率为2.86%，病情指数为0.22，随着日平均气温达到26℃，6月下旬烟草青枯病进入盛发期，8月中旬发病率达到93%以上，病情指数达到40以上。两个地区烟草青枯病始发期都在6月中旬，随着时间的延长，发病率和病情指数逐渐升高，7月下旬进入盛发期，8月中旬进入稳定期。六、烟草青枯病防治1、筛选和利用抗病品种参试共计46个烟草品种苗期温室鉴定：伤根灌菌接种法，接种条件：温度28℃-30℃，RH80%。接种后定期（接种后第5d、7d、10d、15d、21d）调查发病情况。大田病圃鉴定：烟株旺长初期，用小铁铲从烟株茎基部斜插人土使侧根受伤，随后浇灌菌液。每隔10d调查1次发病情况。接种浓度：1×108CFU/mL。编号品种名称编号品种名称编号品种名称1人参烟17蓝玉1号33K42Coker371Gold18G8034Feb-213烤烟-319RG1135CF2034K32620K39936CF9865云烟8721K326LF37中烟986638822K39438龙江9127K823MCN94439吉烟9号8中烟10024Coker31940LZ39RG1725NC8241翠碧1号10CF205（中烟104）26Coker17642K611中烟10327NC56743云烟9712K34628NC9544南江3号13云烟8529V245毕纳1号14FX200130CV8746D10115FY81331CV9116龙江91132K10参试烟草品种《青枯病严重度分级标准》(GB/T23222-2008)0级全株无病1级茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎3级茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧1/2至2/3叶片调萎5级茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达莲顶部，或病侧2/3以上叶片调萎7级茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部调萎9级病株基本枯死《烟草品种抗病性鉴定标准》(GB/T23224-2008)抗病性病情指数高抗（HR）0抗病（R）0.1~20中抗（MR）20.1~40中感（MS）40.1~60感病（S）60.1~80高感（HS）80.1~100苗期鉴定结果苗期鉴定结果：华农温室苗期鉴定结果：华农温室序号抗性评价序号抗性评价序号抗性评价大田苗期大田苗期大田苗期25RHS20MRS7MSHS26RMR19MRMS22MSHS45RMR34MRHS5MSS46RMR36MR