第五章 工业微生物育种诱变剂.jsp

第五章工业微生物育种诱变剂本章内容：化学诱变剂物理诱变剂生物诱变剂2诱发突变(inducedmutation)的发现1927年，Muller用X射线诱发果蝇遗传性状变异。在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变异，其效应与X射线相类似。陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技术——基因诱变在菌种选育中得以应用，使生物诱变剂受到了重视，取得了可喜的发展。•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。诱变剂mutagen：凡是能诱发生物基因突变，且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质。诱变剂种类：化学诱变剂、物理诱变剂和生物诱变剂4第一节化学诱变剂定义：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质。化学诱变剂种类：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变剂。5一、碱基类似物baseanalogue碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基掺入到DNA分子中的一类化合物。主要诱变剂：5-溴尿嘧啶（5-BU）/T2-氨基嘌呤（2-AP）/A诱发的突变：ATGC的转换。1.2.6在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进DNA分子它们产生异构体的频率高，出现碱基错配的概率也高碱基类似物是如何提高突变频率的?（一）碱基类似物的诱变机制——现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴（Br）原子取代，就构成了5-BU的结构式。5-溴尿嘧啶（5-BU）的结构85-溴尿嘧啶（5-BU）的碱基配对9诱发的突变105-BU掺入后的复制错误G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU掺入错误A:T→G≡C•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5-BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。122-氨基嘌呤（2-AP）比较容易诱发AT→GC这一转换13A2AP2AP*GTTCC（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下：1.单独处理新鲜斜面的细菌——转接到前培养的液体培养基中——培养到对数期——离心除去培养液——加入生理盐水或缓冲液——饥饿培养8—10小时——加入5-BU到培养液中，使最后的处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml），加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离于平皿——适温培养——挑取单菌落，进行筛选。2.与辐射线复合处理据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂。16二、化学修饰碱基的诱变剂改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂、烷化剂常见的碱基修饰剂（a）亚硝酸（b）羟胺（c）甲基磺酸乙酯（d）N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍171．脱氨剂亚硝酸（nitrousacid）是典型的脱氨剂亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起碱基转换而发生变异。如脱氨基的结果：G黄嘌呤X（xanthine）CUA次黄嘌呤H18亚硝酸的脱氨基作用及其诱发的突变19亚硝酸诱发的突变HNO2AHGGAATCCCUTHNO2A:TG┆C亚硝酸的处理方法1.试剂的配制（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）•取孢子悬液1ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶液1ml，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温10—20min，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液20ml，使pH下降至6.8左右，以终止反应。稀释分离于平板。•如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将斜面新鲜菌体移入肉汤培养基，适温培养到对数期，将培养液进行离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤。pH4.5醋酸缓冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1:1浓度加入沉淀的菌体中，使之悬浮。于35—37℃处理5—10min、加入5倍的pH8.6的磷酸氢二钠溶液，使pH下降到6.8。取一定量进行后培养1.5—2h。然后稀释分离于平板上。注：在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。222.羟化剂羟胺（hydroxylamine）是典型的羟化剂羟胺的分子式为NH2OH（简称HA）,常以盐酸羟胺形式存在（分子式为NH2OH·HCl），为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，故要密封、干燥保存。羟胺是具有特异效应的诱变剂，专一地诱发G:CA:T的转换。羟胺的诱变机制改变了结构的胞嘧啶根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使A:TG:C转换，进行逆向突变。由于羟胺是诱发G:CA:T的专一性诱变剂，因此，可以用来鉴别突变体是A:TG:C还是G:CA:T转换。羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%，可直接在溶液中处理，时间1—2h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。3．烷化剂——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反应，从而改变DNA分子结构，引起突变。双功能烷化剂单功能烷化剂多功能烷化剂根据烷化剂中活性烷基的数目亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类、乙烯亚胺类化合物硫芥子、氮芥子类等26烷化碱基部分烷化剂部分烷化剂和烷化碱基甲基磺酸甲酯亚硝基乙基脲7-甲基鸟嘌呤3-甲基腺嘌呤O6-甲基鸟嘌呤•烷化剂的诱变机制——烷化剂主要使通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；甲基磺酸乙酯主要使嘌呤N7烷基化。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2、腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10%左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6、胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。如果鸟嘌呤N7等位点被烷化后，它和核糖结合键发生水解反应，引起鸟嘌呤从DNA分子上脱落下来，使DNA链上碱基空缺，在以后的复制过程中其它游离碱基有可能错误掺入。GC就可能变为任何碱基对G:C——A:T转换及G:C——C:G或G:C——T:A颠换而导致突变。由于烷基化后的鸟嘌呤，易离子化，由原来的酮式变为不稳定的烯醇式，不能和胞嘧啶配对，而是与胸腺嘧啶错误配对，结果发生G:C——A:T转换而导致突变。烷化鸟嘌呤的碱基配对烷化剂除了以上诱变作用之外，还有可能使两个鸟嘌呤N7位点形成共价键，一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的交联，造成变异或死亡。鸟嘌呤通过N7位点的共价结合而发生交联33烷化剂作用：通过对鸟嘌呤N7位点的烷化而导致突变有三种可能：烷化嘌呤引起碱基配对错误，脱嘌呤作用，鸟嘌呤的交联作用•总结鸟嘌呤N7位点的烷化作用•烷化剂的性质——烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。——它们大部分半衰期很短，其长度与温度、溶液pH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配。——不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用一样，有的分解产物会失去诱变作用或具毒性。因此，保藏时要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。——另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。烷化剂名称理化特性pH7水中半衰期/h分子量状态水溶性溶点或沸点20℃30℃37℃甲基磺酸乙酯(EMS)无色液体约8%沸点85~86℃/10mmHg932610.4124乙烯亚胺(EI)无色液体易溶于水沸点56℃/760mmHg43亚硝基乙基脲(NEU)粉红色液约5%沸点53℃/5mmHg84117亚硝基甲基脲(NMU)黄色固体35103硫酸二乙酯(DES)无色油状物不易溶3.3410.5亚硝基胍(NTG)黄色固体熔点118℃烷化剂的某些性质•几种常用的烷化剂：1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍，NTG或NG或MNNG）为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO，颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线菌等微生物时，不经淘汰，就可以直接得到10%以上的营养缺陷型突变株。而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。NTG的水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。当溶液pH低于5.5时，NTG分解成HNO2,HNO2本身就具诱变作用；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷（CH2N2），对核酸起烷化作用，引起微生物突变；当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA起烷化反应而导致突变。通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备均悬液都要用适宜的缓冲溶液。常用的由磷酸缓冲液和Tris缓冲液.1.取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107ml-1；NTG的诱变处理方法：2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成1mg/ml。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG最后处理浓度为100μg/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为100—1000μg/ml，而放线菌、真菌孢子为1000—3000μg/ml。3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温处理若干时间。4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度分离于平皿。处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理：1.摇瓶振荡处理2.在平皿上生长过程处理•NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。42甲基磺酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和O-4-E-T分别和T、G配对，导致G∶C对转换成A∶T对；T∶A对转换成C∶GGO-6-E-GATO-4-E-TCCTTAGG43三、移码诱变剂是一类能够嵌入到DNA分子中的物质吖啶类染料（acridinedye）、溴化乙锭（