质粒DNA的抽提、纯化与检测

YL-1分子生物学实验（综合性）质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定常规PCR技术感受态细胞的制备及重组质粒的转化真核细胞基因组DNA的分离、纯化与检测YL-2质粒DNA的抽提、酶切及电泳鉴定实验实验安排上午：质粒DNA的提取与纯化中午：质粒DNA的酶切下午：电泳鉴定质粒(plasmid)：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合环状双链DNA。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。是重组DNA技术中重要的载体。质粒作为载体的质粒：多克隆位点选择标记容纳较大的外源DNA质粒的特性：相对独立性独立的复制单位赋予宿主细胞一些表型与宿主菌染色体DNA不同质粒提取质粒DNA的目的与意义基因载体/基因克隆/基因工程：在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。如何获得批量的纯化质粒DNA分子？（一）载体的制备：质粒DNA的提取与纯化提取方法概述基本步骤培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离、纯化质粒常用方法碱裂解法煮沸裂解试剂盒法氯化铯密度梯度离心法碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理：利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的差异。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。原理示意图溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,（pH8.0）10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl溶液Ⅱ：0.2mmol/LNaOH,1%SDS溶液Ⅲ：pH4.8,[K+]=3mol/L,（pH4.8）[Ac-]=5mol/L重悬细菌；保护和缓冲作用裂解细菌蛋白、DNA变性中和NaOH质粒DNA复性染色质DNA、蛋白不能复性重要试剂碱裂解法提取质粒的流程离心收集菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液1.取1mL菌液于1.5mL离心管中，10000rpm离心1min，弃上清。2.将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，振荡混匀。3.加200μL新鲜配制的溶液II，盖紧管盖，上下轻柔颠倒离心管混匀5次（勿强烈振荡），冰上放置2min。4.加入150μL预冷的溶液III，将管轻柔上下颠倒数次（6-8次）混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3min。碱裂解法提取质粒操作步骤步骤1中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。步骤2中应充分悬浮，使细胞分散混匀。步骤3、4中切记动作轻柔，应缓慢上下颠倒离心管混匀，勿强烈振荡，否则质粒容易断裂。菌液：EcoliJM109菌株(含pUC19-X基因重组质粒)5.12000rpm离心5min，小心吸取上清至干净的1.5mL离心管中。6.加等体积（约450μL）酚:氯仿，混匀，12000rpm离心5min，取上清移至另一1.5mL离心管中。7.加1mL冰预冷无水乙醇，上下颠倒混匀几次，室温放置10min；12000rpm离心5min，弃上清。8.加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。9.弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。10.加20μL含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37℃水浴消化15-30min以去除RNA。碱裂解法提取质粒操作步骤步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染色体DNA也吸走。不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。下一步实验用提取质粒后分装每人最终得到20μL质粒DNA，其中10μL用于酶切，5μL用于电泳，其余5μL用于下次的转化实验，切记！！！作好标记，放在讲台上20μL质粒5μL质粒（冻存）10μL质粒（酶切）5μL质粒（加入15μLTE）实验注意事项移液枪的正确使用标记好自己的离心管加不同溶液要换枪头转移上清时不要吸到沉淀使用酚:氯仿注意安全离心机的使用：严格平衡注意（二）质粒DNA的酶切及电泳鉴定识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列和切割点。例如EcoRⅠ的切割位点：５′－G▼AATTC－３′３′－CTTAA▲G－５′HindⅢ的切割位点：５′－A▼AGCTT－３′３′－TTCGA▲A－５′限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）本实验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段。如果用EcoRⅠ和HindⅢ同时切割重组质粒（含两个单一酶切位点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。3.4kb2.5kb0.9kbEcoRⅠHindⅢ使用限制性内酶切的原则限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；酶的用量可参照酶单位的定义确定；两种以上的酶切割DNA时应选择合适的缓冲液；酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。质粒DNA10μL10×MBuffer2μLEcoRⅠ1μLHindⅢ1μLddH2O6μL21合计20μL准备室老师已将其配成2×限制性酶反应混合液双酶切体系的建立重组质粒的酶切反应5μL质粒（冻存）5μL质粒（加入15μLTE）酶切反应体系质粒DNA10μL2×限制性酶反应混合液10μL20μL质粒10μL质粒（酶切）共计20μL37℃水浴保温2-3h2×限制性酶反应液包含：10×酶反应缓冲液、EcoRI、HindIII核酸电泳核酸分子是两性解离分子，在pH8.0～pH8.5时，磷酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段在凝胶中泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小或构型来使其分离。质粒的三种构型在细胞内质粒常以共价闭环的超螺旋形式存在如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子如果两条链均断开，即为线状DNA超螺旋DNA（CCCDNA）开环DNA（OCDNA）线状DNA(LDNA)电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）最快中最慢重组质粒双酶切电泳酶切质粒线状质粒DNA标准插入片段线性载体DNA标准（Marker）是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题以及估算条带的大小。质粒DNA电泳步骤制胶取酶切后的质粒DNA溶液20μL、酶切对照的质粒DNA溶液20μL，各加5×上样缓冲液5μL，混匀后，用移液枪慢慢将混合物加至样品孔中；另加入5μLDNAMarker至另一样品孔中。电压120V，电泳约40min-1h。点样：开环构型线性构型超螺旋构型（希望得到最多）预期电泳结果点样孔（如果纯化不好，就可能有DNA-蛋白复合物残留）RNA残留酶切后提取的质粒2.5Kb0.9Kb小结1．质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒DNA，利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的差异。2．质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异的DNA序列，并切割双链DNA。本实验中EcoRI、HindIII将3.4Kb的质粒双酶切为2.5Kb和0.9Kb的两个片段。3．电泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶中泳动速度不一样使其分离。思考题1.碱裂解法分离纯化质粒DNA基本原理是什么？结合基本原理分别讲述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ发挥怎样的作用。2.实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？3.如何通过电泳分析判断得到的质粒DNA的质量？4.如果质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结果？