质粒抽提

实验一质粒DNA的提取、纯化与鉴定实验目的掌握质粒抽提的目的了解质粒抽提原理熟悉质粒抽提方法一、实验原理理论基础：宿主染色体DNA与质粒DNA的区别实验操作原理：三个基本步骤细菌培养裂解细菌以及质粒的初步分离质粒DNA的纯化理论基础细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA，独立于细菌染色体之外，能够进行自我复制。质粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、测序、表达等工作。宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别：宿主染色体DNA质粒DNA分子大小分子大分子小抽提结果断裂成为线状共价闭合环状结构实验操作原理分离质粒DNA包括3个基本步骤：⑴培养细菌在含有相应抗性的液体培养基中培养已转染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具有很高的拷贝数。37oC振荡过夜⑵裂解细菌以及质粒的初步分离最普遍采用的方法是碱裂解法。将细菌培养物离心并以缓冲液悬浮，加入SDS溶液破坏细胞，再SDS与加入钾离子沉淀大分子DNA并离心去除，小分子的质粒DNA即处于上清液中。（3）获取高纯度质粒DNA的方法密度梯度离心CsCl密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯度质粒DNA，但繁琐费时。离子交换层析DEAE离子交换层析利用DNA、RNA及蛋白质与DEAE基团间电荷作用的强弱差别分离吸附层析法玻璃珠吸附层析利用DNA在高盐浓度条件下与细小玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。纯化的质粒DNA有三种存在形式共价闭环DNA，即超螺旋形式；开环DNA,即质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。质粒电泳示意图Bestbetternotgood点样孔开环线状双螺旋吸附层析法纯化质粒DNA质粒的快速抽提溶液I含有RNA酶，水解RNA，并为低渗溶液，但由于细菌有细胞壁，因此不会破裂。溶液Ⅱ中的SDS具有强烈的破细胞作用，使基因组DNA释放溶液Ⅲ使基因组DNA与SDS及钾离子结合形成沉淀。将含有质粒的上清加入到层析柱中，利用玻璃珠吸附层析分离质粒。三、质粒抽提操作步骤1.用接种棒取含有质粒的大肠杆菌接种于5ml含有抗菌素的LB培养液，37℃振荡培养过夜（已备）。2.取1.5ml过夜培养物，加入1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液。3.加入250μl溶液PⅠ，旋涡混匀，静置5min。4.加入新鲜配制的溶液PⅡ250μl并轻微颠倒混匀6-8次。在进行混匀时不可振荡，以免基因组DNA断裂，对质粒的纯化造成污染。5.加入溶液PⅢ250μl并轻微微颠倒混匀6-8次。6.离心12000rpm×10min，吸取上清液0.6ml，收集于一个新离心管中。7.将混合液加入放在套管的吸附柱CP3内，离心12000rpm×1min，弃流出液。8.向吸附柱CP3加入漂洗液PW600μl，离心12000rpm×1min，弃流出液。9.重复上一步。10.将吸附柱CP3放入套管，离心12000rpm×2min，将残余的漂洗液去除。11.将吸附柱CP3置入1.5ml新离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液或去离子水，室温静置2min，离心12000rpm×1min，收集流出液。琼脂糖凝胶电泳检测制备1％琼脂糖凝胶:凝胶浓度决定孔径大小，应依据样品DNA分子长度调整。溴乙锭是DNA嵌合剂，与DNA结合后经紫外光照射发出橙色荧光。DNA溶液上样。DNA上样量以观察到清晰条带为宜。一般每个样品孔100ng为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。加样量越少分离效果越好，但溴乙锭的检出灵敏度有限，单一条带的检测低限是2ng左右。电泳。在1％琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于300bp左右DNA片段。根据样品中DNA片段大小，注意指示剂泳动位置。紫外灯下观察结果。紫外灯有长波与短波两种类型。短波(254nm)激发的荧光强度高，对DNA损伤较大。长波(302nm)激发的荧光较低，但对DNA损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型。电泳步骤制备1％琼脂糖凝胶:用1×TBE电泳缓冲液配制1%琼脂糖溶液，微波炉中加热至溶化（2min）。稍等微凉，加溴乙锭2ul，混匀并灌制事先备好的凝胶板。点样：取质粒DNA溶液5μl、上样缓冲液1μl，混匀，上样。电泳150V电泳30分钟，至指示剂泳动至凝胶前缘时停止电泳。紫外灯下观察结果。四、操作注意事项加入溶液Ⅱ、Ⅲ时轻缓颠倒混匀，以免基因组DNA断裂，造成质粒污染。溴乙锭具有极强的致突变能力，使用时需谨慎。由于紫外线可造成视网膜严重损伤，因此不可用肉眼直接观察紫外灯。