质粒的提取及浓度的测定

实验一质粒DNA的提取及浓度测定1.目的与要求通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。2.相关知识及原理质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。质粒类型：•严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；•松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：•易于鉴定；•在受体细胞中可以独立复制；•易于筛选；•易于导入受体细胞。质粒结构：1.抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)2.启始复制子（ori,Originofreplication)；3.多克隆位点(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；4.标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。原理：DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。细菌裂解的方法：•碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS•煮沸裂解法:沸水煮沸40秒•SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。DNA浓度的测定：测定DNA浓度的方法有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；另一种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。3.材料与试剂材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。•Suitablehoststrains:DH5a,HB101,andothergeneralpurposestrains.•Selectablemarker:plasmidconfersresistancetoampicillin(100mg/ml)toE.colihosts.•E.colireplicationorigin:pUC•Copynumber:~500InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T104.步骤A.质粒DNA的提取碱裂解法溶液1－GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，20mmol/L20mMTris-HClpH8.0，100mg/mlRNasA4oC保存。溶液2－0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3－乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70％乙醇1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基，37℃培养12～16小时;2.取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml溶液1，充分混匀;3.加入200ml新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法：4.加入150ml乙酸钾溶液(pH4.8)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5－15min;5.用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;6.沉淀用70％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;7.加入30-50ml灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);8.将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。WizardTMPlusMiniprepsDNAPurificationSystem(Promega)Thispurificationsystemissilicamembrane-basedandmodifiedalkalinelysisprocedurebasedsystem,whichspecificallyabsorbsDNAinthepresenceofhighconcentrationofsomesalt.Proteinsandotherimpuritiesarenotabsorbedandwillberemoved.DNAcanbeelutedunderlow-saltconditionorwater.TheyieldofplasmidDNAwillvarydependingonanumberoffactors.•CellResuspensionSolution50mMTris-HCl(pH7.5)10mMEDT100µg/mlRNaseA•CellLysisSolution0.2MNaOH1%SDS•NeutralizationSolution1.32Mpotassiumacetate(pH4.8)•ColumnWashSolution80mMpotassiumacetate8.3mMTris-HCl(pH7.5)40µMEDTA55%ethanol•TEbuffer(1X)10mMTris-HCl(pH7.5)1mMEDTA注意：•用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA);•加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！！！1.Pellet1–3mlofcellsbycentrifugationfor1–2minutesat10,000×ginamicrocentrifuge.Pouroffthesupernatantandblotthetubeupside-downonapapertoweltoremoveexcessmedia.2.Completelyresuspendthecellpelletin200µlofCellResuspensionSolution(SolutionI）.3.Add200µlofCellLysisSolution(SolutionII)andmixbyinvertingthetube4times.Thecellsuspensionshouldclearimmediately.4.Add200µlofNeutralizationSolution(SolutionIII)andmixbyinvertingthetube4times.5.Centrifugethelysateat10,000×ginamicrocentrifugefor10minutes.6.Pipet1mloftheresuspendedresinintoeachbarreloftheMinicolumn/syringeassembly.(Ifcrystalsoraggregatesarepresent,dissolvebywarmingtheresinto25–37°Cfor10minutes.Coolto30°Cbeforeuse.)7.CarefullyremovealloftheclearedlysatefromeachminiprepandtransferittothebarreloftheMinicolumn/syringeassemblycontainingtheresin.Nomixingisrequired.8.Carefullyinsertthesyringeplungerandgentlypushtheslurryintotheminicolumn.9.DetachthesyringefromtheMinicolumnandremovetheplungerfromthesyringebarrel.ReattachthesyringebarreltotheMinicolumn.10.Pipet2mlofColumnWashSolution(aftertheadditionofethanol)intothebarreloftheMinicolumn/syringeassembly.InserttheplungerintothesyringeandgentlypushtheColumnWashSolutionthroughtheMinicolumn.11.RemovethesyringeandtransfertheMinicolumntoa1.5mlmicrocentrifugetube.CentrifugetheMinicolumnat10,000×ginamicrocentrifugefor2minutestodrytheresin.12.TransfertheMinicolumntoanew1.5mlmicrocentrifugetube.Add50µlofnuclease-freewatertotheMinicolumnandwait1minute.Centrifugeat10,000×ginamicrocentrifugefor20secondstoelutetheDNA.TheDNAwillremainintactontheMinicolumnforupto30minutes;however,promptelutionwillminimizenickingofplasmidsintherangeof20kb.13.RemoveanddiscardtheMinicolumn.Followthesestoragerecommendations:DNAisstableinwaterwithoutadditionofabufferifstoredat–20°Corbelow.DNAisstableat4°CinTEbuffer.TostoretheDNAinTEbuffer,add5µlof10XTEbuffertothe50µlofelutedDNA.B.用分光光度计法定量DNA1.取2ml提取的质粒DNA，加入98ml蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或