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实验二种子带菌的洗涤检验一、实验目的：1）检查种子的内部或表面的带菌情况，可决定该种子是否可作为播种材料；2）经过种子带菌检验后，可决定该种子是否需要处理以及处理的方法；3）通过种子带菌检验确定当年种子的带菌程度，作为预测预报当年病害发生情况的依据之一；4）种子带菌检验是实施植物检疫的常用手段。洗涤检验是植物种子带菌的很重要检验方法，本实验以黄豆种子为材料，通过洗涤检验测定小麦种子的带菌量。通过本实验使学生掌握种子带菌洗涤检验的基本操作方法，并能在实践中加以运用；能对黄豆上重要检疫性病菌进行识别和鉴定。二、实验原理洗涤检验在检疫中广泛用于检查附着在粮食和其它种子表面的各种真菌孢子。如禾谷类种子上的黑粉病菌、小麦矮腥黑穗病菌和甜菜种子表面的甜菜锈病菌的孢子等。其原理是一定量的种子，加入一定体积的无菌水或其它洗涤液，经振荡后可使附着在种子表面的病菌孢子充分洗涤下来。然后直接取悬浮液观察，或悬浮液经离心浓缩后定容至一定的体积（体积大小以便于镜检观察为度），立即取一滴悬浮液滴于载玻片上，用显微镜检查，可鉴定病原种类，并计算每粒种子上的孢子负荷量。三、主要仪器及试材1．主要仪器及用具：台式天平、量筒、烧杯、离心机、光学显微镜、解剖针、血球计数板测微尺、吸管、载玻片及盖玻片等。2．主要试材：黄豆种子。3、其他试剂及用具：蒸馏水、离心管、三角瓶四、实验方法与步骤抽取10g黄豆种子，放入三角瓶内，加入无菌水50ml，振荡5-10min，使附着在种子表面的病菌孢子冲洗下来。将悬浮液倒入洁净的离心管内，2000-4000rpm条件下离心10min，使病原菌孢子完全沉于底管，倒出上清液，每个离心管中加入少量的蒸馏水，振动离心管使沉淀充分悬浮，将各离心管中的悬浮液合并后，用量筒定容至1ml。立即取一滴悬浮液滴于载玻片上，用显微镜检查，观察病原形态，并计算单位重量种子上的孢子负荷量。为保证检测的可靠性，一般对每一样品的洗涤液至少要镜检各5个玻片。计算单位种子的带菌量可采用以下方法。（1）平均视野推算法吸取1滴悬浮液放在玻片上，每个玻片检查10个视野，5个玻片共50个视野，统计观察到的孢子数量，并求出每个视野的平均孢子数。用显微镜测微尺测定在一定的放大倍数下各视野的半径，算出每一视野的面积。根据盖玻片的面积，计算全玻片的视野数，再根据视野数、平均每视野上的孢子数、每毫升的悬浮液滴数计算出单位重量种子的带菌量。单位重量种子的孢子量=(平均每视野孢子数×盖玻片的视野数×每毫升的悬浮液滴数×悬浮液体积)/种子重量（g）（2）利用纽鲍尔（Neubauer）氏血球计数板测定孢子数血球计数计上刻有许多小方格，每一小方格的边长为0.05mm，面积为0.0025mm2，其深度为0.1mm，故每一小方格的体积为0.0025×0.1=0.00025mm3，即1/4000000ml。操作时，先将盖玻片盖在计数板的刻度处，然后用吸管吸取所需测定的悬浮液小心地从玻片的一侧将一滴悬浮液注入计数板刻度处与盖玻片间（注意液体不可溢出，并避免盖玻片下有气泡）。轻压玻片，然后将计数板置于显微镜下检查。通常共观察80个小格（或5大格），统计其中的孢子数量，求出平均每小格内的孢子含量，再乘以4000000，即为1ml悬浮液中的孢子数。由该孢子数乘以悬浮液体积，得出原有悬浮液的孢子总含量，除以检验种子的重量，即单位重量种子上的孢子负荷量。采用以上方法计数时，也可根据单位重量种子的孢子数计算出每粒种子的平均带菌量。即，每粒种子的平均带菌量＝单位重量种子的孢子数/每克种子的种子粒数。五、实验注意事项采用洗涤检验进行定量分析时常因人为操作上的差异而引起一定的误差。如在洗涤的过程中种子表面所粘附的病菌孢子不一定能完全洗涤下来，因此洗涤时应重复振荡，使孢子重复洗涤下来，必要时可将洗涤液分为两份，两次洗涤后将洗涤液合并。此外，孢子分布不均匀，所观察视野或计数板小格不同，其孢子量也有一定的差异，为降低这些差异，可设置一定的重复。六、实验结果处理1.计算单位种子的孢子携带量2.从孢子大小、网脊高度、胶质鞘厚度3方面比较小麦矮腥黑穗病和网腥黑穗病菌冬孢子形态的异同。补充：复习显微镜的正确使用方法