2 细菌耐药机制1

第二章细菌耐药机制第一节抗菌药物作用靶位改变药物作用靶位是抗菌药物与细菌结合并发挥抗菌效果的作用点。靶位结构、数量或亲和力的改变，可阻止药物的结合和作用，使抗菌药物失效或活性减弱，而导致细菌对药物耐药。一、β-内酰胺类抗菌药物β-内酰胺类是临床上最常用的抗生素，其作用靶点是青霉素结合蛋白（penicillinbindingproteins,PBPs）。PBPs是一组位于细菌外膜具有催化作用的酶，参与细菌细胞壁的合成、形态维持和细菌糖肽结构调整等功能。β-内酰胺类抗生素通过抑制PBPs而干扰细菌细胞壁的合成，使细菌变为球形体、丝状体以及分裂障碍，从而达到杀灭细菌的作用。一种细菌通常含有4-8种PBPs。目前研究发现由PBPs改变而引起的耐药细菌主要有以下几种：1.葡萄球菌属正常情况下，金黄色葡萄球菌含有5种PBPs。PBP1是合成细菌细胞壁肽聚糖的；PBP2是细菌处于非生长状态发生作用的转肽酶；PBP3为与细菌分裂有关的转肽酶；PBP4在粘肽二级交联过程中具有转肽酶和羧肽酶的双重活性。目前与金黄葡萄球菌PBPs密切相关的耐药菌是甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistantstaphylococcusaureus,MRSA）。其耐药机制为产生PBP2a和PBP2‘，其中PBP2‘对β-内酰胺类药物的亲和力很低，当β-内酰胺类药物以共价键结合的方式使正常的4种主要PBPs失活，PBP2a可替代完成细胞壁合成的功能，从而产生耐药。编码PBP2a基因为mecA。2.肺炎链球菌肺炎链球菌具有6种PBPs。在耐药青霉素肺炎球菌中，PBP1a、2a、2x、2b对β-内酰胺类药物的亲和力下降。3.革兰氏阴性菌由于G一细菌的产酶机制和通透性等耐药作用明显，PBPs改变在耐药机制中的作用并不显要。二、万古霉素万古霉素是一种高分子量的糖肽类抗生素，它和革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖前体五肽中的D-丙氨酸-D-丙氨酸末端（D-ala-D-ala）结合，抑制细菌细胞壁蛋白合成。绝大多数临床的革兰氏阳性菌，均对万古霉素敏感。而且由于其独特的作用机制，这个临床使用多年的抗生素未见耐药株的报道，它也是治疗MRSA临床感染的最为有效的抗生素。三、大环内酯类、林可霉素、链阳菌素、四环素类、氨基糖苷类此类药物主要通过与细菌核糖体结合，干扰细菌蛋白质的合成，从而发挥抗菌作用。细菌核糖体由大亚基（50S）、小亚基(30S)构成，亚基中mRNA及蛋白质的改变，可引起与抗菌药物亲和力的改变，从而产生对上述几种药物的耐药性大环内酯类抗生素作用于细菌核糖体50S亚单位，通过阻断转肽作用和mRNA位移而抑制细菌蛋白质的合成。大环内酯类耐药菌可合成甲基化酶，使位于核糖体的50S亚单位的23SrRNA的腺嘌呤甲基化，导致抗生素不能与结合部位结合。因大环内酯类抗生素、林可霉素及链阳菌素的作用部位相仿，所以耐药菌对上述3种抗生素同时耐药，称为MLS(macrolide,lincosamide,streptogramins)耐药。此类耐药菌的耐药基因为位于质粒或染色体上的erm(erythromycinresistancemethylase)基因，目前至少已发现8种erm的基因，常见的有ermA、ermC（葡萄球菌属耐药基因）、ermAM（链球菌属耐药基因）。细菌对四环素耐药的主要机制原因是，细菌产生基因tetM编码的6.8×103及7.5×103的可溶性蛋白，该蛋白与核糖体结合，保护核糖体或其他决定簇，从而阻止四环素对蛋白合成的抑制作用。该基因亦与多西环素、米诺环素耐药有关。细菌对氨基糖苷类耐药的主要原因是细菌产生钝化酶，而有些细菌也可通过编码核糖体蛋白的基因突变导致核糖体结构的改变，从而阻止细菌与抗生素的结合。四、喹诺酮类药物旋转酶基因突变可以引起耐药，以大肠埃希菌为显著。大肠埃希菌gryA基因序列上，残基67～106区域常发生突变，因而命名为喹诺酮类药物耐药区（QRDR）。每一种gryA突变都可造成对喹诺酮类中所有药物的交叉耐药。因DNA旋转酶改变而对喹诺酮类抗菌药物产生耐药的细菌主要有金黄色葡萄球菌、肠杆菌和假单胞菌等。gryA蛋白的变异是DNA旋转酶变异的主要表现。细菌gryA基因突变特点是：突变株对大多数QNs交叉耐药，引入野生型gryA基因后可恢复其敏感性。gryA基因还可在几个位点同时发生点突变，多点突变耐药程度更高。gryB担保的变异引起的耐药程度低于gryA蛋白，临床分离菌中也不常见。第二节细菌产生灭活酶或钝化酶一、β-内酰胺酶临床重要的β-内酰胺酶（1）超广谱β-内酰胺酶：超广谱β-内酰胺酶（Extented-Spectrumβ-lactamases,ESBLs）是一类能够水解青霉素类、头孢菌素类及单环类抗生素的β-内酰胺酶，其活性能够被某些β-内酰胺酶抑制剂抑制。该类酶由质粒介导，可在同一种属细菌之间转移散播，造成院内感染爆发流行，为感染控制和治疗带来困难。自1983年在德国首次发现ESBL以来世界各地均有产ESBL菌流行及爆发感染的报道。ESBLs的基因主要由TEM-1、TEM-2、SHV-1基因点突变衍生而来。一般引起1～4个氨基酸改变，导致酶空间构像的变化，酶的活性位点区扩大，易于容纳肟类头孢菌素的庞大侧链，因而酶的水解能力增强。携带ESBLs基因的质粒通常同时携带对其他抗生素耐药的基因，如对氨基糖苷类、磺胺类、氯霉素类和四环素类耐药的基因，因此治疗产ESBL细菌引起的感染非常困难。可以选择应用治疗ESBL菌株感染的抗菌药物，主要有：雅安培南，美罗培南，头孢霉素（头孢美作及头孢西丁），β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂及氟喹诺酮类等，但最近已发现氟喹诺酮类和头孢霉素类抗生素的产ESBL菌株。(2)AmpC酶：AmpC酶是革兰氏阴性杆菌所产生的染色体介导的头孢菌素酶，由ampC基因编码。编码AmpCβ-内酰胺酶的基因常见于染色体上，近年来出现了向质粒转移的趋势，这些酶的编码基因均与ampC基因有很高的同源性。AmpC酶相对分子质量普遍大于3000，等电点偏碱性，水解头孢赛啶和头孢噻吩的能力强于任何一种青霉素，不被酶抑制剂克拉维酸（CA）所抑制，舒巴坦和三唑巴坦的抑制效果亦很差，但通常可为低浓度的胺曲南或邻氯西林抑制，对碳青霉烯类较敏感（如亚胺培南等）。根据能否被β-内酰胺类抗生素诱导，AmpC酶以诱导酶和非诱导酶的形式存在于不同细菌中。诱导性AmpC酶存在于肠杆菌属、枸橼酸杆菌、不动杆菌属、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、吲哚阳性的变形杆菌属中。AmpCβ-内酰胺酶可被诱导产生，因为这些细菌中有AmpCβ-内酰胺酶的调节基因ampR，而产生非诱导性AmpC酶的细菌缺乏该基因。在缺乏β内酰胺类抗生素时，只产生少量的的β-内酰胺酶，当有诱导作用的β-内酰胺类抗生素存在时，β-内酰胺酶的产量明显增加。非诱导性AmpC酶存在于大肠埃希菌、志贺杆菌、克雷伯杆菌属中。其表达不受β-酰胺类抗生素和其他因素的影响，具有代谢调节性。通常只产生低水平的β-内酰胺酶。（3）金属β-内酰胺酶：亚胺培南、美罗培南（meropenem）和比阿培南（biapenem）等碳青霉烯类广谱抗生素对许多耐药菌有很好的抗菌作用。但近年来报道的能水解碳青霉烯的酶数量正不断增加，主要是第三组的金属β-内酰胺酶。金属β-内酰胺酶的主要特征是它们在二价金属离子，主要是锌离子的存在下才有活性，因此能被乙二胺四乙酸等金属螯合剂抑制。二、氨基糖苷类钝化酶•临床上氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制为产生氨基糖苷类钝化酶，许多革兰阴性杆菌，金黄色葡萄球菌和肠球菌等均可产生此类酶。•氨基糖苷类抗生素修饰酶催化氨基糖苷类抗生素氨基或羟基的共价修饰，使得氨基糖苷类抗生素与核糖体的结合减少，促进药物摄取的EDPⅡ也被阻断，因而导致耐药。•现已分离的氨基糖苷类钝化酶有三类：乙酰转移酶（AAC）,磷酸转移酶（APH）、核苷转移酶（AAD），分别通过乙酰化作用、磷酸化作用、核苷化作用灭活此类抗生素，这些酶是由质粒或染色体编码的。•耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因是细菌产生AAC(6’)APH(2’)钝化酶。三、氯霉素乙酰转移酶•某些革兰阴性杆菌、葡萄球菌属、D群链球菌可产生氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素失去抗菌活性。四、MSL类抗生素钝化酶及其他水解酶•MSL类抗生素因其结构的差异，细菌产生的钝化酶也有差异。•所有肠杆菌中的红霉素耐药菌中都存在红霉素酯酶。这些酯酶具有酯解红霉素和竹桃霉素的大环内酯结构。•林可霉素类钝化酶在很多链霉菌中被发现，钝化林可霉素和氯林可霉素的酶是抗生素分子的3位羟基磷酸化或核苷酰化，在葡萄球菌和乳酸杆菌中也发现有这些钝化酶。第三节细菌细胞膜渗透性改变•抗菌药物首先要通过细菌细胞壁、细胞膜，进入细胞内，方可影响细菌的生理、生化过程，产生杀菌、抑菌作用。细菌在对抗抗菌药物的过程中，为了免遭伤害，形成了多种防卫机制，其中可通过细菌细胞膜渗透性的改变减少抗菌药物的进入，而产生耐药性。此种耐药机制往往对抗菌药物特异性较差，具有广泛耐药性，因此，相对来说，临床选择有效药物的难度更大。•一些具有高渗透性外膜对抗菌药物原来敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成耐药性，如原来允许某种抗菌药物通过的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。如β-内酰胺类、四环素类、氯霉素、氨基糖苷类、亲水的氟喹诺酮类药物均主要通过大肠埃希菌外膜孔蛋白(OmpF、OmpC。主要是OmpF)进入细胞内发挥抗菌作用。因此，大肠埃希菌外膜上这些孔蛋白表达水平的变化可对细菌耐药性产生影响。大肠埃希菌多重耐药株缺失OmpF、OmpC。这些孔蛋白的缺失使大肠埃希菌外膜的通透性下降，抗菌药物难以进入细胞，是导致对这些抗菌药物的耐药机制之一。其中OmpF在保持细菌外膜正常通透性中起着主要作用。第四节细菌主动药物外排的耐药机制•药物外排系统（effluxpumpsystem）的耐药机制的研究源于20世纪80年代关于大肠埃希菌对四环素耐药机制的研究，随后是金黄色葡萄球菌对镉耐受性机制的研究。细菌主动药物转运系统根据其超分子结构、机制和顺序的同源性可以将其分为四类：第一类为主要易化（MF）家族：第二类为耐药小节分裂(RND)家族，它也包裹转运钙离子、钴离子和镍离子的转运器；第三类为链霉素耐药或葡萄球菌多重耐药家族，它假定由四种转运膜螺旋组成的小转运器；第四类为ABC(ATP-bindingcassette,ATP结合盒)转运器，它由两个转膜蛋白和两个ATP结合亚基或结构域组成。1998年，Nikaido提出了改进的G一菌的主动外排系统的模式图，见图2-1•外排系统通常为MF和RND家族。其与辅助蛋白如EmrA、AcrA、EnvC和MexA等连接，而这种辅助蛋白又与外膜的通道蛋白相连接。两性药物（amphiphilicdrug）通常通过空通道跨越细胞外膜（如图所示的黑色部分为疏水性末端），然后进入细胞质膜的双层结构中。转运器就是在这双层结构中捕获药物分子并将其泵出，排至细胞外膜屏障外。•主动泵出系统广泛存在与革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性菌（如大肠埃希菌、铜绿假单胞细菌、空肠弯曲菌等）中，在多重耐药中起重要作用，愈来愈受到重视。主动泵出系统运行所需要能量由氢离子药物反转运体逆转H+,形成H+浓度差而产生的势能所提供。•大肠埃希菌被发现是主动外排系统最多的一种细菌，其中与喹诺酮类排出有关的外排系统有EmrA/B、AcrA/B、MdfA、EmrB、AcrB为转运子，通过膜融合蛋白（MFP）类辅助蛋白EmrA、AcrA与外膜通道相连，从而排出底物。前一系统有萘啶酸、有机汞等；后者有红霉素、四环素、新霉素、利福平、氟喹诺酮类等。MdfA泵是一新发现的多药转运泵，受质子电化梯度驱使，它的表达只对红霉素、柔红霉素、利福平、嘌呤霉素、氯霉素、氨基糖苷、氟喹诺酮类耐药。•金黄色葡萄球菌质粒介导的抗性也基于外排机制，某些金黄色葡萄球菌有norA基因，可编码含388