201305 地中海贫血基因检测和结果分析

地中海贫血的实验室检测和结果分析广西区人民医院检验科PCR实验室李友琼主要内容一、什么是地中海贫血及分布二、地中海贫血的致病机制三、地中海贫血的基因诊断四、最新的地中海贫血检测方法五、检测结果分析及报告一、什么是地中海贫血定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白肽链合成减少或缺失，导致血红蛋白的α链/非α链比例失衡，而引起的一组遗传性溶血性疾病，亦称海洋性贫血。血红蛋白病：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白分子的一级结构发生改变，从而导致血红蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病。☆地中海贫血是最常见的血红蛋白病，珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼，国外不用。地中海贫血分类地中海贫血地中海贫血地中海贫血δ地中海贫血γ地中海贫血δ地中海贫血εγδ地中海贫血血红蛋白变异体溶血性异常血红蛋白（如HbS、C等）地中海贫血样变异（如HbCS、E等）其他异常血红蛋白（如HbM、Coimbra等）地中海贫血分类1、按照一个单倍型上的-珠蛋白基因的功能缺陷定义0地贫（也有称地贫1）：-珠蛋白基因完全基因记为--/丧失功能。+地贫（也有称地贫2）：-珠蛋白基因保基因记为-/留有部分功能。地中海贫血分类2、按照肽链内切酶分型缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造成功能缺陷非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是（点突变）由于基因的点突变造成的肽链功能缺陷地中海贫血分类3、根据基因缺失或突变个数可分为：静止型：缺失1个基因，基因型记为-/1个基因突变，基因型记为/T轻型：缺失2个基因，基因型记为：--/或-/-2个基因突变，基因型记为：T/T中间型：缺失3个基因，基因型记为：--/-缺失与突变混合，基因型为：--/T或纯合突变重型：缺失4个基因，基因型记为：--/--缺失与突变混合，基因型为：--/T地中海贫血分类1、根据肽链的功能缺失0地贫：珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链＋地贫：珠蛋白基因尚保留部分功能2、根据临床症状静止型地贫：突变杂合子（N/+），中国人少见轻型型地贫：突变杂合子（N/+、0/N）中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（+/+、0/+）重型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子（0/0、0/+）中国人HPFH和δβ-地贫的基因突变类型及表型特征突变类型缺失长度(kb，缺失型)或受累基因(非缺失型)HbF(%)Gγ(%)其它种族缺失型Gγ+(Aγδβ)0-地贫中国型≈1009.3～21.283～100—广州型＞4319.495—云南型～909.3～16.772～90—GγAγ-HPFH东南亚型29.7±0.514.1～27.057～63越南、柬埔寨人Aγ-HPFH-196(C→T)Aγ14.3～20.981～95意大利人GγAγδβ-地贫-29(A→G)β22.340—世界地中海贫血的流行分布广西地中海贫血的流行分布853共5789例224例834例790例1033例1349例1559例BaiseHezhouYulinFangchengguangLiuzhouNanningXiong,etal.ClinGenet2010广西地中海贫血的流行分布血红蛋白病分组阳性样本数%α-地中海贫血88615.32静止型携带者3636.27α-地中海贫血特征4988.6HbH病250.43β-地中海贫血3706.39携带者2874.96复合α-地中海贫血791.36中间型地中海贫血40.07δ-地中海贫血90.16携带者60.1复合α-地中海贫血30.05血红蛋白结构变异220.38携带者170.29复合α-地中海贫血40.07复合β-地中海贫血10.02总计128722.25引起珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布––MC10kb0kb20kb30kb40kb–10kb3’HVRinterξHVR5’3’2121––THAI––BRIT––FIL––MED––SEA–4.2–3.7–2.7––SPAN––HW–27.6–11.1–2.4BlackBelgianIndianMalaysian2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS.E.AsianTaiwanese0kb50kb100kb150kbGALCR引起地中海贫血常见的基因缺失突变类型分步12种见于中国人群的2/1珠蛋白基因点突变CD31CD125EXONIEXONIIEXONIIIIVSIIVSIIUTRUTR5’3’CD13CD59CD122CD142CD44CD49CD3021MissensemutationMinideletionorinsersionTerminationmutationFrameshift’UTR突变EXON1IVS1EXON2EXON3IVS2显性突变5’3’46种见于中国南方人群的-珠蛋白基因点突变中国南方人群最为常见的地贫类型二、地中海贫血的致病机制●胎儿血红蛋白主要由两条珠蛋白链、两条珠蛋白链组成，还含有γ链、ɛ链、ζ链组成●成年人的血红蛋白由两条珠蛋白链和两条珠蛋白链组成血红蛋白红细胞链链血红素铁链链二、地中海贫血的致病机制11p15.3β珠蛋白基因簇16p13.3α珠蛋白基因簇HbAHS40ζψζψ2ψ121θHS54321εGγAγψβδβ二、地中海贫血的致病机制人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律二、地中海贫血的致病机制静态突变点突变片段突变动态突变碱基替换移码突变串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加缺失重复重排基因突变的分子机制基因致病突变是地贫发生的分子基础二、地中海贫血的致病机制三、地中海贫血基因分析1、Gap-PCR用于α和β等缺失型地贫的检测ψα2ψα1ψξ1α2α1θ1SEA3.74.2ABCDEFG原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。三、地中海贫血基因分析2、PCR-RDB用于检测α和β点突变PCR膜条杂交显色三、地中海贫血基因分析地贫基因检测的策略：α地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点突变），最后是未知的缺失和突变位点。因为90%α地贫为常见的三种缺失型（--sea,-3.7,-4.2)。β地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。大部分β地贫都是点突变型。血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程遗传咨询产前地贫携带者筛查策略同时正常产检对象（孕妇及其配偶）α地贫分子诊断知情同意选择胎儿产前基因诊断血液五分类分析（关注MCV和MCH）+血红蛋白电泳（HbA2)双方某项指标均同时降低一方正常，另一方的指标降低地贫全套检查异常的一方做地贫全套检查α-地贫特征β-地贫特征ID双方均为α-地贫特征一方为α-地贫特征，另一方为ID或β-地贫特征+-单纯性ID或单纯性β-地贫双方均为β-地贫特征ID或β-地贫特征的一方做α地贫分子诊断夫妇双方基因诊断血R正常的一方做α地贫分子诊断-单纯性ID或单纯性β-地贫-++仅异常血红蛋白必要时测序或选择其中一种地贫检测四、最新的地中海贫血检测方法1、融链曲线分析法用于检测α或β缺失和点突变Thongperm,etal.JournalofMolecularDiagnostics.2010XiongF,etal.JMolDiagn.2011ChristinaV，etal.ClinicalChemistry.2003原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断四、最新的地中海贫血检测方法2、MLPA（多重连接探针扩增）用于寻找未知缺失断裂点Xiao-FengWei，etal.AnnHematol.2011四、最新的地中海贫血检测方法3、毛细管电泳可以检测α非缺失CS（HbCS)和βE地贫HbAHbEHbA2CanLiao,etal.EuropeanJournalofHaematology.2010四、最新的地中海贫血检测方法4、DHPLC（变性高效液相色谱）用于缺失型和突变型地贫都可以李倩，南方医科大学论文，2010四、最新的地中海贫血检测方法5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）用于未知突变位点或确定缺失片段的位置由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线推广，只在科研实验室里开展。AzamAmirianMSc，etal.ArchivesofIranianMedicine.2011四、最新的地中海贫血检测方法6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定严提珍，国际输血及血液学杂志，2009严提珍，国际输血及血液学杂志，2009五、检测结果分析及报告（一）地贫基因诊断1、--SEA/2、/3、/4、--SEA/-4.25、--SEA/-4.26、--SEA/-3.77、/8、--SEA/9、DNAMarkerα缺失型地贫电泳结果123456789α非缺失杂交结果CS纯合WS杂合未检测到6种突变（注意不是正常）41-42N654N-28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17MEM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M–28/NIVS-II-654/NCD17/NCD41–42/N–28/–28CD17/IVS-II-654ABCDEFβ–地中海贫血点突变分析结果血涂片染色（包涵体）CornelisLH，OrphanetJournalofRareDiseases，2010五、检测结果分析及报告（三）基因诊断报告单1、临床地贫基因报告主要是常规试剂可以检测到的类型，一般都会包括被测样本的信息，检测方法，检测试剂，检测者的签名，诊断结果以及临床提示。2、临床科研报告由于常规检测不到，但是患者又必须进一步检测确定的罕见或未知地贫类型。报告信息只包括被测样本信息，检测方法，检测试剂，诊断结果及临床提示，没有检测者的签名（不承担法律后果）。地贫基因分析诊断报告单（alpha地贫）新修改的报告单α珠蛋白基因缺失和发生的三联体基因座的分子机制