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第5章基因工程基本流程——筛选与鉴定1.抗药性筛选法pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。基于载体遗传标记的筛选与鉴定原理：234（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：pBR322抗生素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Ampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：5选择过程如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活6无环丝氨酸培养基7（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。82.-半乳糖苷酶显色反应筛选法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色原理载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。9选择过程10-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。113.营养缺陷型筛选法原理载体能够合成某些生长必须营养成分，受体菌基因突变不能合成这种生长必须的营养物质。在缺少该营养物质的培养板上涂布细菌，长出的菌落均含有载体的，是否重组子需进行第二轮筛选。12选择过程营养缺陷型受体营养合成型载体134.噬菌斑筛选法原理以λ-DNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受体，转化子在培养板上形成噬菌斑。取代型载体，噬菌斑即为重组子；插入型载体需进行二次选择14选择过程15基于克隆片段序列的筛选与鉴定1.PCR鉴定法原理：针对已知目的片段特异性扩增。包括：区分重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目的片段是否整合在受体基因组上。PCR鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。16选择过程1）从重组克隆中提取质粒（或基因组DNA）2）用相应引物进行PCR反应3）电泳PCR产物4）检查是否有PCR产物5）PCR产物的长度是否与外源基因一致原理图p58172.Southernblot杂交原理：从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用特异性探针（与目的基因同源）进行核酸杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。18选择过程Southernblot流程193.菌落/噬菌斑原位杂交原理：特异性探针（与目的基因同源）进行的核酸原位杂交20探针的制备及标记，p60选择过程214.R-环检测法原理：DNA-RNA杂交：外源基因的mRNA与重组载体杂交22选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。23缺点：需要电镜245.Northernblotting原理：从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。主要检测插入片断是否被转录。检测表达载体。25选择过程Northernblot流程266.直接电泳检测原理：有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大27选择过程从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。分子量Marker载体重组克隆287.限制性酶切图谱法限制性酶切图谱：核酸经限制性内切酶消化成片段，用电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱。29在外源片段大小及限制性酶切图谱已知的条件下，选择一两种内切酶切割载体，电泳后比较电泳结果(DNA条带数目和分子大小）差异进行区分。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。原理：30ABA或B31不同克隆的酶切结果32选择过程表型筛选加酶切筛选AATTAATT338.DNA序列测定原理：通过对插入片段序列的测定确定是否是所需的重组子34选择过程双脱氧末端终止法化学降解法焦磷酸降解法高通量Solexa测序……3536基于外源基因表达产物的筛选与鉴定1.蛋白质功能检测原理：外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应的检测方案针对表达载体的检测方法37待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗38选择过程1)弥补缺陷转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长39例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长2)增加新性状使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。403)酶活性检测针对外源基因表达产物是酶。①扩散免疫沉淀检测分泌型产物原理：抗原——抗体凝集反应方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。4243②酶联免疫吸附测定（ELISA）原理：一抗（primaryantibody）：与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linked）二抗：携带能催化无色底物转变为有色物质（或发光）的酶，再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。44待测基因产物蛋白一抗二抗酶待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶45方法：固定样品一抗结合二抗结合显色/发光反应比色2.放射免疫原位检测利用抗体作为“探针”原位检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。蛋白——蛋白杂交原理：46选择过程473.westernblotting蛋白——蛋白杂交原理：48选择过程westernblot过程多抗Blotting结果单抗blotting结果494.蛋白凝胶电泳待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。原理：5051选择过程SDS-PAGE，染色不适于筛选5.转译筛选法借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。原理：5253选择过程mRNA无细胞翻译系统35S标记的甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体+外源DNA转录与预期的产物分子量相符？6.DNA-蛋白质相互作用筛选检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。ChIP、EMSA、甲基化干扰实验……5455待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的DNA序列放射性标记原理：一般克隆与筛选策略56