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第五章病毒一、病毒的一般特性二、噬菌体一、病毒的一般特性1、病毒的概念：病毒：是一类超显微的非细胞生物,每一种病毒只含有一种核酸;它们只能在活细胞内营专性寄生;在离体条件下,它们以无生命的化学大分子状态存在.病毒粒子：完整的、具有感染性的病毒颗粒。2、病毒的基本特点个体极小（以nm计），能通过滤菌器，形态多样，有球状、杆状、复合型。无细胞结构，主要由蛋白质、核酸构成，一个病毒体内仅含一种核酸，核酸以单链或双链形式存在。生活方式为专性活细胞内寄生，病毒酶系不全，离开活体后无生命特征。病毒以复制的方式增殖,包括核酸复制、核酸蛋白质装配，是在分子水平上进行的。对抗生素不敏感，对干扰素敏感。3、病毒的形态构造及化学组成（1）、形态（2）化学组成主要由核酸和蛋白质组成。较复杂的病毒还含有脂类、多糖等。（3）结构核衣壳（基本构造）核心：由DNA或RNA构成病衣壳：由许多衣壳粒蛋白构成毒包膜（非基本结构）：由类脂或脂蛋白构成刺突（非基本结构）衣壳粒是由一种或几种多肽链折叠而成的蛋白质亚单位，衣壳粒的排列组合方式不同，使病毒表现出不同的构型和形状。衣壳核酸包膜刺突核衣壳病毒的基本结构：三类典型形态的病毒：•廿面体对称的结构(球状)•螺旋对称的结构(杆状)•复合对称的结构(蝌蚪状)大肠杆菌的T4噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是病毒中复合对称的代表。二、噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，可以通过滤菌器；没有完整的细胞结构，主要由蛋白质构成的衣壳和包含于其中的核酸组成；只能在活的微生物细胞内复制增值，是一种专性细胞内寄生的微生物。噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应的噬菌体的存在。噬菌体在自然界广泛存在，在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种，分别划归为49个病毒科.据Bradley(1967)归纳，噬菌体共有六类形态。噬菌体很小，在光镜下看不见，需用电镜观察。不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。（一）噬菌体的形态结构与组成以大肠杆菌T4噬菌体为例头部：廿面体对称结构，由蛋白质衣壳构成，内含一条DNA。颈部：薄盘状，附颈须。尾鞘：长95nm,衣壳粒螺旋对称；可伸缩。尾髓:中空，DNA可由此进入细胞。基板:六角形盘状物，其上有刺突、尾丝。刺突:有吸附功能。尾丝:有识别吸附功能。2、蝌蚪形噬菌体的构造大肠杆菌T4噬菌体构造化学组成：噬菌体主要由核酸和蛋白质组成。核酸为噬菌体的遗传物质，为DNA或RNA，并由此将噬菌体分成DNA噬菌体和RNA噬菌体。蛋白质构成噬菌体头部的衣壳及尾部，起着保护核算的作用，并决定噬菌体外形和表面特征。抗原性：噬菌体具有抗原性，能刺激机体产生特异性抗体。抵抗力：噬菌体对理化因素及多数化学消毒剂的抵抗力比一般细菌的繁殖体强，75℃30min灭活。噬菌体能耐受低温和冰冻，但对紫外线和X射线敏感。（二）、噬菌体(phage)的繁殖噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，产生许多子代噬菌体，能够使宿主细胞裂解的噬菌体.温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：即吸附、侵入、复制、装配和释放。1、烈性噬菌体的繁殖噬菌体的吸附（Absorption)吸附是噬菌体侵染宿主细胞的第一步吸附过程决定于：1）细胞表面受点的结构；2）噬菌体的吸附器官吸附过程为噬菌体的吸附器官于敏感细菌细胞表面的敏感接受点相互特异性的互补不可逆接合一种细菌细胞表面可被多种和多个噬菌体吸附感染。据测定，一个细菌细胞表面可被250~360个噬菌体吸附达到饱和量吸附受环境因子温度、pH、阳离子浓度等影响噬菌体的吸附与侵染图侵染即注入核酸噬菌体以其尾部固着于敏感细菌细胞表面后，将尾丝展开固着于细胞，尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生一个小孔，然后尾鞘收缩，将头部的核酸通过中空的尾髓压入细胞内，而蛋白质外壳则留在细胞外。此过程可在几十秒内完成通常一种细菌可受到几种噬菌体的侵染，但细菌细胞一般只允许一种噬菌体进入细胞。往往先进入的噬菌体可排斥或抑制后进入者。即使进入了，也不能增殖而消亡尾鞘并不是侵染的必备条件，无尾鞘者也可有效侵染，但有尾鞘者可提高侵染效率噬菌体的侵入(Penetration)噬菌体的侵入包括噬菌体DNA的复制和蛋白质的合成DNA的复制：噬菌体进入细胞后立即以噬菌体DNA为模板，利用细菌原有的RNA合成酶合成早期的mRNA，由早期mRNA翻译成早期蛋白质。这些早期蛋白质是病毒复制所需的酶及抑制细胞代谢的调节蛋白在这些酶催化下，以亲代DNA为模板，半保留复制出子代DNA在DNA开始复制后转录的mRNA为晚期mRNA，再由晚期mRNA翻译成晚期蛋白质即噬菌体外壳的结构蛋白，如头部蛋白质、尾部蛋白质此时为潜伏期，在细胞内还观察不到噬菌体粒子潜伏期（Latentperiod）是指噬菌体西于宿主细胞至宿主细胞裂解，释放噬菌体的最短时间噬菌体的复制(Replication)主要步骤有：DNA分子的缩合——通过衣壳包裹DNA而形成头部——尾丝及尾部的其它部件独立装配完成——头部与尾部相结合——最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。噬菌体的装配(Assembly)方式：裂解：多以裂解细胞的方式释放。分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100——300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长。大肠杆菌的T偶数噬菌体从吸附到粒子成熟释放需15～30min。噬菌体的释放(Lysis)一步生长曲线1.实验设计依据：1个菌体被1个噬菌体感染,避免二次吸附；细菌群体被噬菌体同步感染。2.实验过程:敏感菌10mlPhage1ml混匀，5min,使之吸附离心或用抗phage血清处理,去除过量phage高倍稀释,吸附phage的菌悬液(避免多次吸附)37℃培养,定时取样取样人为裂解处理（每5min）样品中加入氯仿裂解细胞24-48h裂解液加入敏感菌液中适当稀释混合液涂布于琼脂培养基上计数噬菌斑噬菌斑:概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。)应用:噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。噬菌斑噬斑荧光假单胞菌噬菌斑(plaque)以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标,绘制成的曲线为一步生长曲线。可分以下阶段：潜伏期裂解期稳定期一步生长曲线潜伏期：从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体之前的这段时期.曲线平行于横轴，噬菌体数无变化.样品中无游离的噬菌体。(潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数,也就是感染噬菌体的细菌数).裂解期：曲线直线上升,子代噬菌体不断释放到培养基中,直到达到一个极限.稳定期:感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。裂解量:每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。稳定期噬菌斑数裂解量=潜伏期噬菌斑数不同的噬菌体或同种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同,与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及环境因数有关。2、温和噬菌体与溶源性细菌温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。原噬菌体（或前噬菌体）：即整合在宿主核DNA上的噬菌体的核酸。溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖,而不被裂解。溶原性细菌的特点：可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-2～10-5。可诱导裂解：用化学、物理方法诱导具有“免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。可复愈：自然遗失前噬菌体，但不发生自发裂解和诱导裂解溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。（三）、噬菌体的危害和应用噬菌体的危害：主要是引起发酵中的噬菌体污染例：丙酮、丁醇发酵中的噬菌体污染抗生素发酵中的噬菌体污染食品工业上的噬菌体污染防治：控制活菌排放选育抗性生产菌株生产中轮换使用菌种药物防治例如用金霉素、四环素等。噬菌体的应用：1.作为分子生物学研究的工具：噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，且易获得大量的突变体。2.用于鉴定未知菌，可到型：噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。噬菌体的应用：3.用于临床治疗传染病：但由于噬菌体过于专一，限制了噬菌体在临床上的广泛应用。4.检验植物病原菌5.测定辐射剂量