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RNA的转录与转录后加工第六章6.3转录后加工•不论原核或真核生物的rRNA都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。•绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始在DNA上的合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程；•相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分开的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA（hnRNA）。•hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。6.3.1mRNA的加工修饰•原核生物中转录生成的mRNA为多顺反子，即几个结构基因，利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA，所以此mRNA分子编码几种不同的蛋白质。•例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因，转录生成的mRNA可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶、透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核模，所以转录与翻译是连续进行的，往往转录还未完成，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。•真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。•真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5′端和3′端的修饰以及对中间部分进行剪接。1．在5′端加帽•成熟的真核生物mRNA，其结构的5′端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。鸟苷通过5′-5′焦磷酸键与初级转录物的5′端相连。当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN时，此时形成的帽子被称为“帽0”，如果除m7G-PPNmN外，这个核糖的第“2”号碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，称为“帽1”，如果5′末端N1和N2中的两个核糖均甲基化，成为m7G-PPNmPNm2，称为“帽2”。•真核生物mRNA5′端帽子结构的重要性在于它是mRNA做为翻译起始的必要的结构，为核糖体识别mRNA的提供了信号，这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5′外切核酸酶的攻击。•5′端加“G”的反应是由腺苷酸转移酶催化完成的，帽子结构是GTP和原mRNA5′的三磷酸腺苷（或鸟苷）缩合反应的产物。•mRNA的帽子结构常常被甲基化，由尿苷酸-7-甲基转移酶来催化。•帽子结构的功能：•①对翻译起识别作用。•②可以保护mRNA免遭核酸酶降解。•不是所有的真核生物mRNA都有5′端帽子结构。2．在3′端加尾•多聚（A)尾巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNA的游离3′-OH端，并加上约200个A残基。•大多数的真核mRNA都有3′端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大约为200bp。•近年来已知，在大多数真核基因的3′一端有一个AATAA序列，这个序列是mRNA3′-端加polyA尾的信号。靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键，在polyA聚合酶催化下，在3′-OH上逐一引入100-200个A碱基。有人推测polyA可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关，但是相当数量的没有polyA尾巴的mRNA如组蛋白mRNA，也照样通过核膜进入细胞质。还有人认为这种结构对真核mRNA的翻译效率具有某种作用，并能稳定mRNA结构，保持一定的生物半衰期。内含子的可能功能：•①内含子通过启动子、起始位点的碱基配对，可以阻止或增强RNA聚合酶的作用；•②内含子具有各种剪接信号，不同的细胞可以选择不同的拼接点，对外显子进行有选择地拼接，形成不同的成熟mRNA；•③内含子也许有自已特定的蛋白质编码。•切除内含子的过程称为RNA的剪接RNA的三种剪接方式：•⑴自我剪接内含子能够自发地进行剪接，又分为Ⅰ型内含子和Ⅱ型内含子两个亚类。•⑵由蛋白酶参与剪接的内含子主要在tRNA前体中发现。•⑶由snRNAP参与剪接的内含子存在于绝大多数真核细胞的蛋白质基因中。•（什么是“snRNAP”？•在真核生物的细胞核中，含有大量的小分子RNA，在天然状态下，它们以核糖核蛋白粒子形式存在，称为snRNAP。）•原核生物的结构基因是连续编码序列，而真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段（外显子）连接起来（图）•真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子，也含有无表达活性的内含子，但内含子序列是无意义的，越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达调控，在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。•在细胞核中hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA，这就是剪接作用，也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用，例如α-干扰素基因，图以卵清蛋白基因为例，介绍一个典型的转录及加工过程。卵清蛋白基因转录及加工过程图中外显示以1、2、3、4……表示，内含子以A、B、C、D…表示•（1）•Ⅰ型内含子的自我剪接•四膜虫35SrRNA前体的剪接反应是Ⅰ型的典型代表。•特点是需要鸟苷参与。•（2）Ⅱ型内含子的自我剪接•不需要鸟苷参与，而由其自身结构决定。•特点是形成套索内含子。•（3）核蛋白介导的剪接•核mRNA前体的剪接机制：•①U1snRNP结合于内含子的5′端；•②U2snRNP结合到内含子的分支点上；•③U5snRNP结合到内含子的3′端，U4/U6snRNP结合于U5；•④U1和U2结合，形成套索RNA结构；•⑤U4释放，内含子左侧切断，5′外显子作为独立片段释放；•⑥内含子的3′剪接点切断，形成套索内含子，游离出来；•⑦5′外显子和3′外显子连接形成成熟mRNA。mRNA前体拼接机制•mRNA拼接反应需要有核内小分子RNA参与，它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒，snRNA分别被命名为U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。snRNA中的U2RNA由与内含子右端拼接部位附近的UACUAA顺序高度互补，形成一个环状结构，由特定的酶来识别切除该环状结构，完成拼接过程。•真核生物mRNA前体在剪接过程中，还可以形成套索样的结构，在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基，它的2’-OH可以自动攻击内含子5′端与外显子1连接的磷酸二酯键，切开了外噗子1，而腺苷酸原来已有3′，5′--磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基，加上此3′，5′-磷酸二酯键连接后，在腺苷酸处出现了一个套索，已被切下的外显子1的3′-OH攻击内含子3′末端与外显子2之间的3′，5′-磷酸二酯键，键断裂后，内含子以套索的形式被节下来，此时外显子1和外显子2可以连接起来•真核生物rRNA前体中含有插入顺序，rRNA前体要形成成熟的rRNA，需要经过拼接反应。例如，四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内，26srRNA编码的区域内有413bp的插入顺序。该插入序列可以不消耗能量从rRNA前体中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法，都不能破坏拼接活性，但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必需的。用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入顺序5′端发生亲核反应，同时GMP与5′端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。•第二步是5′切点的外元3′-OH与3′切点的外元5′-P共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从5′端去掉一个15核苷酸碎片。剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的（图四膜虫rRNA前体的自我剪接）。•从大多数Ribozyme的结构中发现一些特征，例如：锤头状结构的RNA分子有13个保守的核苷酸序列，如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。根据这种特片，科学家们在体外设计并人工合成这种RNA分子，用于抗肿瘤及抗病毒的实验中（图:锤头结构模式图）。（三）tRNA转录后的加工修饰•原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3′-OH连接-ACC结构（图:tRNA前体的加工）。•①tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定小的tRNA分子。大肠杆菌RNaseP可特异剪切tRNA前体的5′旁顺序，因此，该酶被称为tRNA5′成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前体的剪切尚需要一个3′-核酸内切酶，这可将tRNA前体3′端的一段核苷酸序列切下来。此外RNaseD是tRNA3′端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白质组成，最近发现RNaseP分子中的RNA部分在某些条件下，可以单独地催化tRNA前体的加工成熟，这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。•说明RNA分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。•②成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基，因此tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mG。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变成假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基成为次黄嘌呤核苷酸（Ⅰ）•③3′末端加上CCA：在核苷酸转移酶作用下，3′--末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。复制和转录的异同点相同点：1.都以DNA为模板2.原料为核苷酸3.合成方向均为5′→3′方向4.都需要依赖DNA的聚合酶5.遵守碱基互补配对规律6.产物为多聚核苷酸链•不同点：复制转录•模板两股链均作为模板模板链作为模板•原料dNTPNTP•聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶•产物子代DNA双链mRNA;tRNA;rRN•配对A-T；G-CA-U；T-A；G-C•★引物需RNA引物--------•★方式(特点)半保留复制不对称转录7.2.1反转录酶的发现•1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了以RNA为模板合成DNA的酶，并因此于1975年获诺贝尔生理学与医学奖•后来发现在哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶7.2RNA的反转录DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制7.2.2反转录的过程7.2.3反转录酶的特点7.2.4反转录病毒的生活周期7.2.5人类免疫缺陷病毒（Humanimmunedeficiencyvirus,HIV）——————艾滋病的病原体⒈生物学特征：逆转录病毒，毒粒大小为100～140nm，病毒蛋白主要有核蛋白、膜蛋白及与复制有关的酶蛋白3种，有两条相同的RNA单链，细胞膜芽生。艾滋病病毒模式图⒉艾滋病的发病机理•HIV进入人体后能选择性地优先侵入有CD4受体的T淋巴细胞。•HIV病毒在宿主细胞复制开始，首先二条RNA在病毒逆转录酶的作用下逆转为cDNA，再以cDNA为模板，在DNA多聚酶的作用下复制DNA。•机体细胞免疫和体液免疫对HIV的抵抗作用，使感染初期的HIV低水平复制。•这些DNA部分存留在细胞浆内，进行低水平复制；部分与宿主细胞核的染色质DNA整合在一起，成为前病毒，使感染进入潜伏期。•经过2-10年的潜伏性感染阶段，当受染细胞被激活，前病毒DNA在转录酶作用下转录成RNA，RNA再翻译成病毒蛋白质，经过装配后形成大量的新病毒颗粒。•这些大量的新病毒颗粒释放出来后，继续攻击其他细胞，使CD4+T淋巴细胞、单核—巨噬细胞、B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞等功能受损，导致机体整个免疫功能缺陷，最终发生一系列顽固性感染和肿瘤的发生。•⒊爱滋病的感染途径•爱