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第二节海洋药用活性成分的提取分离方法2.1活性成分提取方法（1）溶剂提取法：提取（Extraction），或称抽提，是用溶剂（常称为浸取剂）使固体原料中的有效成分溶解并释放出来的过程。提取可分为有机溶剂提取(OrganicSolventExtraction)和水提取(WaterExtraction)。溶剂提取法溶剂的选择：根据相似相溶原理，选择提取的溶剂。低极性化合物多选择亲脂性溶剂；高极性化合物多选择亲水性溶剂。溶剂提取法常用有机溶剂的极性大小顺序：甲醇＞乙醇＞丙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞环己烷＞石油醚。溶剂提取法溶剂的选择：一般可将海洋生物按极性递增的方式，用不同的溶剂，如石油醚（可提取出叶绿素、油酯、游离甾体及三萜类化合物）、氯仿或乙酸乙酯（可提取出游离生物碱、有机酸等中等极性化合物）、丙醇或乙醇、甲醇（可提取出苷类、生物碱盐等极性化合物）及水（可提取氨基酸、糖等水溶性成分）依次进行提取。溶剂提取法溶剂的选择：除了要考虑极性外，理想的有机溶剂还应具备下述条件：（1）溶剂不能与天然产物发生化学反应，特别是不可逆反应；（2）溶剂对目标活性物质溶解度大，对杂质溶解度尽可能小；（3）有机溶剂要来源广泛、经济、安全、毒性小等。溶剂提取法温度的选择：（1）提取可以在室温下进行，也可以加热。一般来说，冷提杂质较少，而热提效率较高。（2）为了不影响活性成分的性质，提取液浓缩一般在60℃以下进行，尽可能采用减压浓缩的方式。水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的海洋生物药用成分的提取，主要为挥发油或者挥发性成分。这些化合物与水不相混溶成仅微溶，且在约100℃时有一定的蒸汽压，当水蒸气加热沸腾时，能将该物质一并随水蒸气带出。如挥发油类化合物。水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法（1）取供试品适量（约相当于挥油0.5～1.0mL），称重（准确至0.01g），置烧瓶中，加水300~500mL（或适量）与玻璃珠数粒，振摇混匀后，连接挥发油测定器与回流管。（2）自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。水蒸气蒸馏法（3）置电热套中或用其他适宜方法缓缓加热至沸，并保持微沸约5h，至测定器中油量不再增加，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5处为止。（4）放置1h以上，再开启活塞使油层下降至基上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，计算。水蒸气蒸馏法挥发油（%，质量浓度）=V/W×100%或挥发油（%，质量分数）=（V×D）/W×100%式中V为测得挥发油体积，ml；W为供试样的量，g；D为挥发油的相对密度。溶剂萃取法萃取（Extraction）是利用溶质在互相不能任意混溶的两相（如氯仿和水）之间分配系数的不同而使溶质得到分离的操作技术。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。溶剂萃取法萃取操作中至少有一相为流体（液体或超临界流体），一般称该流体为萃取剂（Extractant）。以液体为萃取剂时，如果含有目标产物的原料也为液体，则称此操作为液－液萃取；如果含有目标产物的原料为固体，则称此操作为液－固萃取（亦称提取或浸取）。溶剂萃取法（1）液－液萃取液－液萃取又称之为有机溶剂萃取或溶剂萃取。作为一项传统的分离技术，由于操作简单，无需特殊的仪器设备，因此，在分离纯化海洋天然小分子物质中发挥着极为重要作用。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取以超临界流体（SupercriticalFluid）为萃取剂的萃取技术称为超临界流体萃取（SupercriticalFluidExtraction，SFE）。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取超临界流体是指处于临界压力和临界温度以上状态的流体，此时物质既不是气体也不是液体的状态。临界温度是指该物质处于无论多么高的压力之下都不能被液化的最高温度，与之对应的压力称为临界压力，超临界流体操作过程中，含有目标产物的原料可以是液体，也可以是固体。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取超临界流体最常用的萃取剂是CO2，主要有如下的性质：①无毒和不易燃性。CO2作为萃取剂，主要是它无毒、不易燃易爆，有较低的临界温度和临界压力，易于从混合物中分离出溶质。②有较低的临界温度和临界压力。CO2的临界温度为31.1℃，临界压力为7.3Mpa，CO2的临界条件比水更容易达到。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取③超临界流体的传递性质。超临界流体的密度接近于液体的密度，而黏度却接近于气体，自扩散能力比液体大100倍，与液体萃取相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取④超临界流体的溶解性。超临界流体的溶解度与密度有很大关系，在临界点附近，压力、温度的微小变化会引起流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取⑤超临界流体的萃取选择性。超临界流体应具有良好的选择性，根据相似相溶原理，如果超临界流体与萃取物质的化学性质越相似，溶解能力就越大。溶剂萃取法（2）超临界流体萃取SFE－CO2特别适用于热敏性、易挥发、易氧化成分的分离，可实现对海洋天然小分子化合物的纯化与精制。如：海洋生物中n－3高度不饱和脂肪酸(HUFA)，特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，海洋生物毒素、萜类化合物、海洋天然色素、某些稀有氨基酸等。（1）叶绿素叶绿素是陆生植物和海洋植物中普遍存在的绿色色素，一般不具有生物活性，能溶于一般有机溶剂，也难溶于水。2.2分离纯化方法杂质处理方法杂质处理方法（1）叶绿素生药用水提取时，水提液中叶绿素可以用苯或者氯仿抽提除去。如果是用酒精提取，酒精浓缩液加水，放置冰箱，叶绿素常可以沉淀出来。用70％左右的酒精提取时，回收酒精至浓缩液中含有15～20％左右时，放置冰箱，绝大部分叶绿素可沉淀出来。杂质处理方法（2）油脂、蜡和树脂一般在提取之前，先用石油醚或苯提取，把这些物质除去。如果不预先处理，直接用酒精提取，提取液蒸去大部分酒精后用石油醚或苯抽提可除去油脂和蜡等。杂质处理方法（3）无机盐少量无机盐一般不影响分离，有时水提取液中有大量无机盐。一般可将水提取液蒸干，加无水酒精或甲醇提取有机成分。如果有效成分溶于水，不溶于酒精就不能用这种方法。如果有效成分溶于乙酸乙酯、氯仿等则可用它们来萃取水液，无机盐留在水液中。杂质处理方法（4）鞣质明胶沉淀法：样品水溶液加4％明胶水溶液，至沉淀完全，过滤，滤液减压液缩至小体积。加3～5倍酒精，使过量明胶沉淀；然后滤去沉淀。如果过量明胶尚未除尽，可将滤液浓缩后，再用酒精沉淀一次。也可以将加明胶沉淀后的混悬液，于水浴上热，不断搅拌，沉淀逐步凝结，将上清液倾出，减压浓缩，再按前述方法除去过量明胶。杂质处理方法（4）鞣质生物碱沉淀法：常用的是咖啡因，其他生物碱及吡啶也可。样品水溶液加入1.5％咖啡因水溶液至沉淀完全，过虑，滤液用氯仿振摇，除去过量的咖啡因（注意水溶液中的其他活性成分是否被氯仿提出），即得除去鞣质的水溶液。沉淀中可回收咖啡因和鞣质。将沉淀置于空气中自然干燥或低温烘干，研磨后溶解于50～55％的热甲醇溶液中，用氯仿萃取。咖啡因进入氯仿层，鞣质里在稀甲醇溶液中。杂质处理方法（4）鞣质醋酸铅沉淀法：试液中加入饱和醋酸铅水溶液至沉淀完全，鞣质被沉淀出。杂质处理方法（4）鞣质聚酰胺法：鞣质是一类多酚类物质，很容易吸附于锦纶柱上。低分子鞣质的吸附是可逆的，可采用适当的溶剂洗脱除去。高分子鞣质与锦纶的吸附是不可逆的，吸附后很难洗脱。无论什么样的鞣质，与锦纶的吸附比任何化合物都强，因此可以用锦纶除去。杂质处理方法（4）鞣质氨水沉淀法：将含有鞣质的乙醇溶液，加氨水调节到合适的PH值至沉淀完全，过虑即可。2.3结晶和重结晶结晶的目的在于进一步分离纯化，便于进行化学鉴定及结构测定工作。海洋植物中大多含有固体化合物，且具有结晶的通性，可以根据其溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。结晶和重结晶一般能结晶的化合物可望得到单纯晶体，纯化合物的结晶有晶学特征，这有利于化合物性质的判断，所以结晶是研究分子结构的重要步骤。一般能结晶的大部分都是比较纯的化合物，但并不一定是单体化合物，有时结晶也是混合物。结晶和重结晶（1）结晶的条件：浓度：需要结晶的溶液，往往呈过饱和状态。通常是在加温的情况下，使化合物溶解过滤除去不溶解杂质，浓缩、放冷、析出。有效成分在样品中的含量和浓度是影响结晶的一个重要因素。一般来说，含量越高越容易析出结晶，但是有时溶液太浓，粘度大反而不易结晶，如果浓度适中，逐渐降温，有可能析出纯度较高的结晶。结晶和重结晶（1）结晶的条件：溶剂：合适的溶剂，是影响结晶的另一个重要条件。有时有效成分在有关部位中含量即使很高，因溶剂选择不当，就得不到结晶；反而有时有效成分含量不是很高，但是选择溶剂恰当的时候就能够得到结晶。结晶和重结晶（1）结晶的条件：温度及环境：结晶最合适的温度为5～10℃它左右，可放置于阴凉处或冰箱中。放置对形成结晶来说也是一个需要注意的方面，它可使溶剂自然挥发到适当的浓度即可析出结晶。结晶过程中尽量避免挪动结晶用的器皿，保证结晶过程不受外界干扰，在自然的情况下进行。结晶和重结晶（2）结晶溶剂的选择：选择合适的溶剂是形成结晶的关键，最好它能对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差别，同时不产生化学反应，即热时溶解，冷时则析出。对杂质来说，在该溶剂中应不溶或难溶。亦可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶，则可用洗涤法除去杂质后再用合适溶剂结晶。结晶和重结晶（2）结晶溶剂的选择：一般游离的生物碱可溶于下列溶剂：苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯和丙酮。而盐类常不溶于苯、乙醚、乙酸乙酯；大多数能溶于乙醇、甲醇、水。甙类可溶于各种醇（甲醇……戊醇）、丙酮。乙酸乙酯、氯仿等；难溶于醚、苯。各类型的甙，由于甙元的不同，其溶解性差别很大。氨基酸在水中的溶解度很大，可考虑在甲醇或者乙醇中结晶。结晶和重结晶（2）结晶溶剂的选择：另一方面也可进行少量探索，参考“相似物溶于相似物”的粗略规律加以考虑，如极性的羟基化合物易溶于甲醇、乙醇或水；多羟基化合物在水中比在甲醇中更易溶解；芳香族化合物易溶于苯和乙醚；杂环化合物可溶于醇，难溶于乙醚或石油醚；不易溶解于有机溶剂的化合物可用冰醋酸或吡啶。结晶和重结晶（2）结晶溶剂的选择：常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙醋等。但所选用的溶剂的沸点应低于化合物的熔点，以免受热分解变质。溶剂的沸点应低于结晶时的温度，以免混入溶剂的结晶。结晶和重结晶（2）结晶溶剂的选择：不能选择适当的单一溶剂时可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂。要求低沸点溶剂对物质的溶解度大、高沸点溶剂对物质的溶解度小，这样在放置时，沸点低的溶剂较易挥发，而比例逐渐减少易达到过饱和状态，有利于结晶的形成。选择溶剂的沸点不宜太高，要适中约在60℃左右，沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制；太高则不使浓缩，同时不易除去。结晶和重结晶（3）重结晶溶剂的选择：重结晶用的溶剂一般可参照结晶的溶剂，但也经常改变，因形成结晶后其溶解度和原来在混杂状态下不同，有时需要采用两种不同的溶剂分别重结晶才能得到纯粹的结晶，即在甲溶剂中重结晶以除去杂质后，再用乙溶剂重结晶以除去另外的杂质。结晶和重结晶（4）结晶制备方法：结晶形成过程包括晶核的形成与结晶的增长两步骤。通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤、浓缩至适当体积后，塞紧瓶塞，静置。如果放置一段时间后没有结晶析出，可松动瓶塞，使溶剂自动挥发，可望得到结晶，或可加入少量晶种，加晶种是诱导晶核形成的有效手段。结晶和重结晶（5）难结晶和非结晶化合物的处理化合物不易结晶，其原因一种是本身的性质所决定，另—种在很大程度上是由于纯度不够，夹杂不纯物引起的。若是后者就需要进一步分离纯化，若是