第八章 免疫标记技术

1第八章免疫标记技术中国药科大学微生物与免疫学教研室王慧2免疫标记技术免疫标记技术是指用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原所进行的抗原抗体反应;三大标记技术:同位素标记技术免疫荧光技术酶免疫测定3标记免疫技术1.免疫荧光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫测定（enzymeimmunoassay，EIA）3.放射免疫测定法（radioimmunoassay，RIA）4.化学发光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）5免疫印迹法（immunoblotting,Westernblot)4第一节放射免疫测定法（radioimmunoassay,RIA）5放射性同位素(131I,或125I)标记Ag或Ab测定Ab或Ag,通过测定放射活性判断结果。该法常用于测定微量物质:如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及lgE等。6VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA7与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功；开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。8优点：①特异性强，即抗原抗体的特异性反应；②灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；③操作流程简单易行，测量和数据处理自动化；④样品用量少、无需复杂的提纯步骤；⑤应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。缺点：需要昂贵的检测仪器；同位素污染。9原理是建立在标记抗原（或配体）和待测抗原（或配体）对有限量的特异性抗体（或受体）的竞争性抑制反应基础上的，最终形成的放射性标记复合物与被测配体（或抗原）呈负相关，因而亦称竞争性放射免疫技术。10Ag*+Ab↔Ag*-Ab（F）（B）+Ag↕Ag-Ab11RIA测定原理的定量示意图Ag*AgAbAgAb游离AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/812返回13第二节免疫荧光法(immuno–fluorescencetechnique)14原理免疫荧光技术又称荧光抗体法。将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪（荧光显微镜或用流式细胞仪）测定或定位被检抗原或抗体。异硫氰酸荧光素(FITC)呈黄绿色荧光;巯基化藻红蛋白(PE)呈橙红色荧光。1516激发光和发射光17抗原抗体反应的高度特异性荧光的敏感可测性显微技术的高度精确性准确、特异、灵敏、快速地检测和定位微量物质。18优点：特异性强，速度快，敏感性高，能准确检测少量抗原或抗体在组织细胞内的定位分布。缺点：非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足。返回19建立技术的必备条件1．荧光素2．荧光素与蛋白质结合物的制备3．荧光检测仪返回20荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质。21荧光的种类自发荧光二次荧光22常用的荧光素返回23荧光检测仪（1）荧光显微镜（2）荧光分光光度计（3）流式细胞仪（4）荧光偏振光分析仪24荧光显微镜25荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯26分类：（1）直接荧光法:（2）间接荧光法:（3）流式细胞术(flowcytometry):样品(细胞)经各种荧光素标记的不同抗体染色后可同时分析细胞表达的多种分子。27(1)免疫荧光法：①直接法:简单、快速、特异;敏感性差。将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。28返回29②间接法:可检测多种不同的抗原抗体复合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程长、干扰因素多。将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。3031③补体荧光染色法：将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高；但操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。323334特殊染色法①双标记免疫荧光技术②双色免疫荧光技术③反衬染色法返回35①双标记免疫荧光技术在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行免疫荧光染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同类型的抗原。如：FITC（黄绿色荧光）和RB200或TRITC9（桔红色荧光）。36②双色免疫荧光技术如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（碘化丙锭）。37双重染色标本的单色和双色观察WUWIBDUALBANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI38多重染色标本的多色观察（FITC+TexasRed+DAPI）返回3940③反衬染色法是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。如：用RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体。4142流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。4344FACS组成示意图Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)46流式细胞仪实验原理4748表达量检测49细胞凋亡研究PI染色50AV-PI双染色51血液学应用：包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等52胞内细胞因子的检测53T细胞亚群分析54第三节免疫酶技术（enzymeimmunoassaytechnique）1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs两组学者分别用酶代替放射性同位素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术（enzymeimmunoassay，EIA）。55第三节酶免疫测定法(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技术是通过适当的酶促化学反应和免疫反应，使抗体（或抗原）与酶蛋白分子结合，形成酶标抗体（或抗原）,该结合物保留免疫学活性的酶活性,因而既有抗原抗体反应特异性,又有酶促反应的特异性。酶分解底物后的显色深浅可反映标本中抗原或抗体的含量。常用酶：辣根过氧物酶、碱性磷酸酶。常用方法:酶联免疫吸附试验――ELISA56一、原理E：酶；S:底物；P:有色产物；D1：供氢体；D2：D1的氧化型有色化合物将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。57优点：①灵敏度高，特异性强；②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体；③试剂稳定，保存时长，无同位素污染；④可肉眼半定量，也可仪器（低廉）定量检测；⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。缺点：标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。58建立技术的条件1．标记酶2．免疫酶结合物的制备3．酶标检测仪59常用的标记酶①辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）②碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）③葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）④-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）606162二、基本类型1.均相酶免疫测定法酶增强免疫技术；酶减弱免疫技术；辅基标记技术2.非均相酶免疫测定法ELISA(直接法、间接法、夹心法、竞争法、抗酶抗体法）1971年建立，称为酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）63直接ELISA间接ELISA（用于检测Ab）64directELISA（forAg）65directELISA（forAb）返回666768返回69（3）夹心法（sandwichassay）70夹心法71双夹心法返回727374ELISA双抗体夹心法(测Ag)间接法(测Ab)加Ab,清洗加Ag形成复合物，洗涤加该Ag的另一Ab（酶标），洗涤加底物，读数加Ag，清洗加Ab形成复合物，洗涤加酶标二抗加底物，读数聚苯乙烯微量反应板7576抗酶抗体法（PAP）77血清IgE的检测实验材料酶标板（聚苯乙烯微量板）马抗人抗体—（购自北京中山公司）辣根过氧化物酶（）标记的马抗人抗体—待检血清包被缓冲液：碳酸钠碳酸氢钠洗涤液封闭液：溶液反应终止液：78实验方法包被酶标反应板：加马抗人抗体（），孔℃孵育小时后洗涤次，分钟次，孔，℃过夜孔↓℃孵育后，洗涤同上酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，孔℃孵育后，洗涤同上底物：加入（邻苯二胺）溶液，孔↓室温分钟终止液：加入，孔↓内，用酶标仪测定各孔值，测定波长实验结果用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值（）表示，当大于某一数值时（如）判断为阳性，数值的大小依具体检测要求而定。79（4）竞争法a．固相抗体竞争法b．固相抗原竞争法80a．固相抗体竞争法81b．固相抗原竞争法返回82夹心ELISA竞争ELISA（用于检测大分子Ag）（用于检测小分子Ag）83返回（5）抗体桥联法（immunobridge）84（6）抗酶抗体法（peroxidase-antiperoxidase，PAP）85PO抗PO法返回86酶联免疫斑点法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。8788ELISPOT&ELISAELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。89原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。90DirectandIndirectElISPOT可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞（直接法），或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中（间接法）。方法选择基于：1）检测细胞的类型；2）希望得到的细胞量。若只需少量的细胞因子生成细胞，使用直接法；反之，最好使用间接法。其它步骤一致。91ElISPOT操作过程92939495操作过程1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。2.倒去酒精，用100ulPBS洗涤3次