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细胞计数与冻存王凌宇wlyvictor@163.com细胞计数•血细胞计数器：手工计数细胞•Coulter计数仪：人工计数•流式细胞仪（flowcytometer;FCM）•实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。•具体操作：•1.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。•2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。•3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。•按公式计算：•细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104•说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数•公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为•1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000mm3•（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）手动计数器台盼蓝法•原理：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力•操作：细胞加10%台盼蓝染色•实际操作：直接加50%台盼蓝，稀释倍数=2，便于计算细胞冻存和复苏•细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序标准程序：•当温度在-25℃以上时，1～2℃/min•当温度达-25℃以下时，5～10℃/min•当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中•细胞冻存器简易程序：•将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。低温保护剂的应用•在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。•常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法1.预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4年后，存活率可达80％－100％。DMSO液用培养液配好，•避免因临时配制产热而伤害细胞。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。细胞种板•1.细胞计数•2.制备细胞悬液•终浓度1万/ml：原始细胞悬液+新鲜培养基•3.种板•100ul/孔•注意：制备悬液时计算需要的体积•每人种一排细胞种板