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资料3证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件3.1功能类别及作用机理3.2拟添加的食品中添加与否的效果对比3.3与同一功能类别的食品添加剂使用效果的对比资料3.4其他有关技术上确有必要的资料资料3.1功能类别及作用机理1一、维生素K2（发酵法）的功能类别维生素K2（发酵法）属于营养强化剂维生素K来源之一，可用于补充维生素K。天然维生素K包括维生素K1（Phylloquinone）和维生素K2族（Menaquinones，MKS）。饮食是维生素K的天然来源。维生素K1主要来源于绿色蔬菜，而维生素K2主要来源于发酵食品，包括：蛋黄、黄油、牛肝、部分乳酪和纳豆等。表1为各类食物中维生素K的含量情况。表1.食物中K族维生素含量（维生素K浓度范围为μg/100g或μg/100mL）食品K1MK-4MK-na肉类0.5－51－30ndb鱼类0.1－10.1－20.1－2水果0.1－3ndnd绿色蔬菜100－750ndnd纳豆20－40nd900－1200谷类0.5－3ndnd乳酪0.5－100.5－1040－80其它乳制品0.5－150.2－150－35蛋类0.5－2.510－25nd人造黄油/植物油50－200ndnd酒类ndndndaMK-n包括除MK-4以外所有其他甲萘醌类型b未检出（L.J.Schurgers等，JournalofNutritional&EnvironmentalMedicine(1999)9:115-122[3]）人体内肠道微生物是天然维生素K2的另一个来源。不同种属的微生物合成的维生素K2种类不同。国际上，科学家们的共识是：维生素K2人体拥有（由肠道微生物微量生物合成），但人体不能合成。不同地域、不同饮食习惯居民，体内维生素K2含量不同[4]，健康状况不同。以植物性食物为主的国家、民族或居民，人体内所含的维生素K2量极少；以发酵食品、肉类和蛋类为主食的国家、民族或居民，人体内维生素K2量稍多些。例如，日本国民健康良好及寿命较长，与该国国民习惯长期食用纳豆相关。日本传统的发酵食品纳豆由纳豆枯草芽孢杆菌发酵而成，含有丰富的维生素K2系列产物，其中含量最高的为MK-7（甲萘醌-7或七烯甲萘醌），下图列出了纳豆中不同形式的甲基萘醌的总量。234.707.513.899884.1001002003004005006007008009001000μg/100g纳豆K1MK-4MK-5MK-6MK-7MK-8MK-9维生素K类型图1.纳豆中不同形式维生素K的含量（0代表未检测到）（数据来自LeonJ.Schurgers,&CeesVermeer.Haemostasis,30:298-307,2000[5]）中国居民的饮食结构主要以植物性食物——谷物为主食，动物性蛋白、豆制品及乳制品等优质蛋白摄入较少，每日从食物中摄入的维生素K2量极低。有人计算过，如果每日要从食物中获得45μg的维生素K2，则大约需摄入4公斤的牛肉、5升牛奶、5升的酸奶或是140克蛋黄。肠道菌群发育不完全的新生儿或肠道菌群失调人群，其肠道微生物合成维生素K2量不足，有必要通过配方食品补充维生素K2，以满足机体需求。这对于特殊人群如儿童、孕产妇及老人等尤为重要。随着科学研究的不断拓展，相信维生素K2将不断拓宽使用人群和范围。二、维生素K2（发酵法）的作用机理在70年前，人们便已经知道维生素K在凝血过程中是必需的。在被发现之初，人们仅知道维生素K在血块的形成过程中起到调节作用。维生素K族中的维生素K2，特别是维生素K2中来源于纳豆的MK-7，在近年来受到科学家们的高度关注。随着研究领域的深入和拓展，维生素K2的多功能性，如对骨骼健康、心血管健康、肿瘤抑制及阿尔茨海默病等方面的作用已不断得到证实。欧洲食品安全局在2009年发表的科学意见[6]中，明确了维生素K按照要求可宣称：“维生素K有促进骨骼、心脏、血管等健康的作用”。在此科学观点中，特别提到维生素K2中的MK-7可以宣称“MK-7是一种具有高生物利用度的维生素K，能够帮助维持骨骼健康”和“MK-7可以维持心血管系统健康”。1.凝血活性3维生素K的经典作用是维持机体的正常凝血功能，配方食品中添加维生素K1，有助于预防出血。维生素K2具有与维生素K1相同的生理功能，能促进肝脏合成凝血酶原（即凝血因子II)，调节另外3种凝血因子（Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ因子）的合成。其凝血机制是作为谷氨酸-γ-羧化酶的辅酶，将凝血酶原中谷氨酸残基羧化成γ-羧化谷氨酸残基(gamma-carboxyglutamate，缩写为Gla)，从而具有与Ca2+结合的能力，并连接磷脂表面和调节蛋白，具有凝血活性。维生素K缺乏，因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ及Ⅹ合成停留于前体状态，凝血酶原时间延长，易引起出血。在儿童配方乳粉中强化维生素K2，可避免由于饮食缺乏或肠道代谢紊乱造成的维生素K缺乏，而引起的出血症状。孕产妇通过食用强化维生素K2的配方乳粉，可使体内维生素K2水平提高，通过母乳哺育，提供给新生儿。新生儿体内维生素K2的提高，有助于防止由于其消化道发育不完全，肠道菌群合成维生素K2不足，而引起的新生儿出血。2.对骨骼健康的作用维生素K对骨骼健康的促进作用已被证实。近年来，维生素K2对骨骼健康的作用引起科学家们越来越多的关注。钙化组织中含Gla的蛋白主要有骨钙素(boneGlaprotein，缩写为BGP或Osteocalcin，缩写为OC)、基质γ-羧基谷氨酸蛋白(matrixGlaprotein，缩写为MGP)和蛋白S。在维生素K依赖的羧化酶作用下，骨钙素上的谷氨酸残基被羧化为Gla，羧化后的骨钙素被激活，Gla与羟基磷灰石钙结合、沉积，促使骨矿化。体内缺乏维生素K2将使得骨钙素羧化不全，形成羧化不全骨钙素（undercarboxylatedosteocalcin，缩写为ucOC）。体内ucOC含量与骨质疏松及骨折机率成正比。在饮食中补充维生素K2可降低血清中ucOC，减少骨折机会，大量的国内外临床试验证明了，补充维生素K2对骨骼健康有积极作用。体外试验（见表2）及临床试验（见表3）汇总如下。表2.维生素K2（MK-7）促进骨钙含量增加的体外试验参考文献试验对象剂量/持续时间结论MasayoshiYamaguchi,etal.InternationalJournalofMolecular年轻雌性大鼠（4周龄）或老年雌性大鼠（50周龄）股骨骨干Dullbecco's改良的Eagle's培养基（含4.5%高浓度葡萄糖）同时辅以抗生素与牛在老年大鼠体外获得的股骨，骨干和-干骺端组织中，MK-7（10-6或10-5M）的存在能使钙含量，碱性磷酸酶活性和脱氧4参考文献试验对象剂量/持续时间结论Medicine,Vol.10:729-733,2002[7]和干骺端组织血清白蛋白，进行培养48h核糖核酸（DNA）显著增加。这些结果表明，MK-7具有在老年雌性大鼠体外的股骨组织中对骨形成具有刺激作用。MK-7可能对老化引起的骨骼退化有预防作用。MasayoshiYamaguchi,etal.MolecularandCellularBiochemistry,Vol.223:131-137,2001[8]1.年轻雄性大鼠（4周龄）股骨骨干、干骺端组织；2.成骨细胞MC3T3-E1细胞。1.股骨骨干、干骺端组织在含有空白对照或MK-7（10-7~10-5M）的培养基中进行培养48小时；2.成骨细胞的MC3T3-E1细胞的传代培养后在含有MK-7（10-7~10-5M）的无血清培养基中培养24h。MK-7存在下，细胞中蛋白质含量，碱性磷酸酶的活性，骨钙蛋白和DNA含量的显著增加。这种作用能被环己酰亚胺完全抑制。研究表明，MK-7在体外的具有对骨组织和成骨细胞MC3T3-E1细胞有同化作用，这表明该化合物可刺激成骨细胞的骨形成。MasayoshiYamaguchi&ZhongJieMa.MolecularandCellularBiochemistry,Vol.228:39-47,2001[9]1.骨髓细胞；2.大鼠股骨细胞；3.大鼠股骨干骺端组织。1.骨髓细胞在PTH（10-8M）或PGE2（10-6M）下培养7天；2.大鼠股骨细胞在含空白对照或MK-7（10-8~10-5M）的MEM中培养48小时；3.大鼠股骨干骺端组织在含有PTH（10-7M），或PGE2（10-5M）的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养48h，加入MK-7MK-7可抑制由骨吸收剂引起的破骨细胞的形成；可使成熟的破骨细胞数量减少；能抑制骨吸收剂引起的骨钙含量的下降。这项研究表明，MK-7在体外具有对破骨细胞的骨吸收的抑制效果。5参考文献试验对象剂量/持续时间结论（10-7~10-5M）或不加入MK-7对比。MasayoshiYamaguchi,etal.JournalofBoneandMineralMetabolism,17:23-29.1999[10]卵巢切除（OVX）模型大鼠1.自由摄取含甲萘醌-4试验饲料（MK-4;12mg/100g饲料）或甲萘醌-7（MK-7;18.1mg/100g饲料）为期24天；2.自由摄取含有发酵大豆（纳豆;含9.4μgMK-7/100g饲料）试验饲料，添加或不添加MK-7（37.6μg/100g饲料），喂养77天。OVX大鼠的血清和股骨中MK-4和MK-7浓度显着增加；由切除卵巢引起的在股骨干重和股骨钙含量的下降，被喂养MK-4或MK-7所抑制；含有纳豆与添加MK-7组，由OVX引起的股骨干重和股骨钙含量降低被显著抑制。这项研究表明，饮食中的MK-7的摄入量对卵巢切除引起骨质流失有预防作用。这种效应可能部分是由MK-7的降解形成的MK-4所引起。Y.Ehara,etal.ResearchinExperimentalMedicine,196:171-178,1996[11]正常大鼠和模拟失重大鼠的股骨干骺端组织含空白对照或维生素K2（甲基萘醌-7，10-6和10-5M）的培养基中培养48h正常大鼠的干骺端组织在维生素K2的作用下，碱性磷酸酶活性和钙含量显着增加。此外，在有效浓度的硫酸锌（10-5M）的存在下，干骺端组织的碱性磷酸酶活性和钙含量在正常组大鼠和模拟失重组大鼠均显着增加。这项研究表明，对于由模拟失重造成骨量的减少，维生素K2（甲基萘醌-7）在锌离子的存在下，对小梁骨的钙化作用增强。这种锌离子的增强作用，可能基于骨组织中新的合成蛋白有关。体外数据可以看出，MK-7在体外试验中，10-8~10-5M的剂量能有效刺激骨的形成，抑制骨吸收。6表3.维生素K2（MK-7）对骨骼健康的临床研究参考文献试验对象剂量/持续时间结论M.H.J,etal.OsteopotosInt.,24:2499-2507,2013[12]244名绝经期妇女，分安慰剂组和MK-7组服用含维生素K2180μg/天的胶囊3年，每一年测定血液中ucOC（未羧化的骨钙蛋白）和羧化骨钙蛋白（COC）MK-7摄入显著提升维生素K的含量，减少绝经期妇女与年龄相关的腰椎和股骨颈BMC（骨矿物钙）及BMD（骨密度）的降低，但在臀关节未能观察到。MK-7能有益于增强骨的强度，能够显著降低低胸部位椎骨的骨折风险。Y.Fujita,etal.OsteoporosInt.,23:705-714,2012[13]1,662名日本社区老人自行服用每袋含有维生素K120μg和维生素K2380μg的纳豆产品，测定骨密度及未羧基化的骨钙蛋白。根据自行服用报告，发现大量进食纳豆能显著降低血浆ucOC浓度，增加骨密度，减少由于低骨密度引起的髋关节和股骨颈骨折的风险。MariekeJ.H.,etal.BritishJournalofNutrition,102:1171–1178,2009[14]55名健康青春期前儿童分成2组试验组每日服用含45μgMK-7的胶囊，持续8周服用MK-7血液中未羧基化骨钙蛋白的浓度降低，未羧基化骨钙蛋白与羧基化骨钙蛋白比值降低。LeonJ.Schurgers,etal.Blood,109:32