植物病原细菌研究方法

植物病原细菌研究方法植物保护学研究方法系列专题内容提纲：细菌的基本形态特征常规细菌生理生化检测方法细菌种类鉴定方法植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法有益细菌的利用研究细菌的基本形态特征细菌（bacteria）是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。细菌的形态和大小细菌的细胞结构细菌的繁殖与群体形态（一）细菌的大小细菌大小的测定：(1)测量：测微尺(2)长度单位：微米(μm)(3)表示：球菌：直径杆菌：宽×长螺菌：宽、长、螺距通常球菌直径：0.2—1.5μm，杆菌:长1—5μm,宽0.5—1μm。例如：大肠杆菌：平均长度：2μm；宽度0.5μm1500个大肠杆菌头尾相接等于3mm;109个大肠杆菌重1mg.由于菌种不同，细菌的大小存在很大的差异；对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。菌名直径或宽×长（μm×μm）乳链球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌霍乱弧菌0.5~10.8~10.5×(1~3)(0.8~1.2)×(1.2~3)(0.2~0.6)×(1~3)细菌细胞的大小（二）、细菌的形态不同细菌的形态可以说是千差万别，丰富多彩，但就单个有机体而言，其基本形态可分为球状、杆状与螺旋状三种.除了球菌、杆菌、蛆旋菌三种基本形态外，还有许多具其他形态的细菌。例如柄杆菌细胞上有柄、菌丝、附器等细胞质伸出物，细胞呈杆状或梭状，并有特征性的细柄；球衣菌能形成衣峭，杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状,而支原体由于只有细胞膜，没有纫胞壁，故细胞柔软，形态多变，具有高度多形性。另外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。球状、杆状和螺旋状细菌的三种基本形态:1.球菌单球菌双球菌链球菌四联球菌八叠球菌葡萄球菌2.杆菌杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八”字状以及有鞘衣的丝状等。2.杆菌短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌链状杆菌单杆菌2.杆菌杆菌细胞两端的形态特征2.杆菌3、螺旋菌螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌：螺旋满2—6环，螺旋状例：干酪螺菌螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软。例：梅毒密螺旋体螺旋菌弧菌螺旋体3、螺旋菌细菌的特殊形态：柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细菌、贝日阿托氏菌(丝状)、具有子实体的粘细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。细菌的特殊形态二、细菌的细胞结构基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、间体、核糖体、气泡和储藏物。特殊结构包括：荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。细菌细胞结构1.固体斜面培养2.液体培养基3.半固体培养植物病原细菌概述绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为25-28℃，少数可以20℃或在35℃中（如青枯菌）生长。植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比较敏感，一般在50℃左右的热水中处理10分钟即失活，适宜的pH为6-7。植物病原细菌的革兰氏染色（细菌的革兰氏染色反应是细菌分类鉴定的一个重要特征）常规细菌生理生化检测方法细菌细胞壁的结构革兰氏阳性菌细胞壁：由肽聚糖和磷壁酸组成磷壁酸：占40%。G+菌所特有,其主链由数十个磷酸甘油或磷酸核糖醇组成,有的还有由D—Ala和还原糖组成的侧链。肽聚糖:占30~70%,不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同。革兰氏阴性菌细胞壁：分内壁层和外壁层。内壁层：紧贴胞膜,仅由1—2层肽聚糖分子构成,占细胞壁干重5-10%,无磷壁酸。外壁层：位于肽聚糖层的外部。脂多糖;脂蛋白、包括:蛋白质层:基质蛋白、外壁蛋白;磷脂.革兰氏染色的原理革兰氏染色原理：第一步：结晶紫使菌体着上紫色；第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内；第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应；G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。基本步骤：涂片固定——结晶紫初染1min——碘液媒染1min——95%乙醇脱色0.5min——番红复染min结果:革兰氏阳性菌——紫色；革兰氏阴性菌——红色。①革兰氏染色法：实验材料待测细菌枯草芽孢杆菌（G+）甘蓝黑腐病菌（G-）染液：结晶紫草酸铵染剂、鲁戈尔碘液、复染剂（番红O）用具：移植饵、清洁无脂载玻片清洁无脂载玻片阳性对照菌（紫色或蓝黑色）待测菌阴性对照菌（红色）示范图对照菌呈现正确颜色，实验才为成功涂片干燥固定染色1min水洗、吸干镜检简单染色制备涂片标本→染色阳性菌阴性菌①革兰氏染色法革兰氏染色阴性——大肠杆菌革兰氏染色阳性——枯草芽孢杆菌注：（1）、实验细菌为活跃生长期的培养物；（2）、菌液不能太浓，涂片不宜过厚，造成假阳性；（3）、火焰固定涂片，以载玻片不烫手为宜；（4）、脱色时间把握好，过长，假阴性；过短，假阳性。鞭毛：某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、毛发状的结构。鞭毛具有运动功能，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而动，它们是细菌的“运动器官”。鞭毛的长度：一般为15—20µm，最长可达70µm。鞭毛的直径：为0.01—0.02µm.不同细菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛数目一般一至数十条。细菌鞭毛染色鞭毛的着生方式：周生鞭毛的化学组成：主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、脂类和核酸等。鞭毛起源于细胞质膜内侧的基粒。细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞外部。鞭毛的结构：鞭毛丝鞭毛鞭毛钩基体鞭毛的观察：电镜特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察半固体穿刺培养从固体培养基上的菌落形态判断一般情况下：菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭毛。实验菌种及药品1．菌种：枯草芽孢杆菌2．染液染液A：单宁酸5.0g氯化铁（Fecl36H2O）1.5g福尔马林（15％）2.0ml（15%福尔马林：40%甲醛4ml+蒸馏水6ml）NaOH(1%)1.0ml蒸馏水100ml染液B：硝酸银2g蒸馏水100ml三、染色方法：银盐染色法硝酸银溶于蒸馏水中。取10ml作回滴用，向其余90ml硝酸银溶液中逐滴加浓氢氧化铵，先形成很浓的沉淀，再继续滴加浓氢氧化铵至沉淀消失为止。然后慢慢滴入备用的硝酸银溶液则出现少量雾状沉淀，但轻轻摇动后，沉淀又消失，再滴入硝酸银溶液，直到摇动后雾状沉淀不再消失为止。此液不耐保存，4小时内染色效果最佳。菌体鞭毛菌体鞭毛菌体鞭毛芽孢概念：某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的休眠体。芽孢能形成芽孢的细菌种类：在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。产生芽孢的几个属：芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属芽孢乳杆菌属生孢八叠球菌属（其中的一个种）芽孢的形态及其在细胞中的位置：A近中央B末端C中央细菌芽孢的各种类型芽孢的组成和结构芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心.芽孢的结构芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差,不易着色。核心含有大量的DNA、RNA、蛋白质酶等物质，还含有2,6—吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。一般以DPA—Ca的形式存在。皮层主要含芽孢肽聚糖、DPA—Ca，皮层体积大，比较致密。芽孢平均含水量低,约40%.芽孢的特性:具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色。新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。一个芽孢萌发产生一个个体。芽孢的抗热机制：目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。芽孢染色（孔雀绿藏红染色）染剂Ⅰ孔雀绿水溶液5％染剂Ⅱ藏红水溶液0.5％或碱性品红水溶液0.05％染色方法：1、涂片固定；2、加染剂Ⅰ在酒精灯火焰上加热染色1min，勿使染液沸腾和干燥；3、水洗；4、染剂Ⅱ染色15s；5、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢染成绿色。芽孢菌体常规鉴定方法全自动微生物鉴定仪--Biolog植物病原细菌的鉴定方法编号形状大小фmm颜色突起表面边缘透明度色素01-144圆2~3灰白平展粗糙不齐不透明无01-182近圆1~2暗白乳状光滑整齐不透明无01-188圆1.5~2灰白乳状光滑整齐不透明无菌落特征比较•常规细菌鉴定方法参考：东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001特征B.subtilis01-14401-18201-188革兰氏反应++++原生质中不着色小球––––孢子:椭圆或柱形+椭圆椭圆椭圆孢囊膨大––––运动性++++接触酶++++厌氧生长––––V-P反应++++终PH值5.0~8.07.26.45.4生长：50℃d+++55℃––––pH5.7++++7%NaCl++++淀粉水解++++产酸:D-葡萄糖++++L-阿拉伯糖++++D-木糖++++D-甘露醇++++葡萄糖产气––––硝酸盐还原++++形成吲哚––––利用：柠檬酸盐++++丙酸盐––––分解：酪素++++酪氨酸––––明胶++++卵黄反应––––苯丙氨酸脱氨––––全自动微生物鉴定仪--Biolog鉴定原理Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。主要特点·快速读取结果鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和打印。·强大的数据库Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计1973种微生物，几乎涵盖了所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。BIOLOG在植物病原菌鉴定方面可鉴定常见的假单胞菌(Pseudomonas,77种)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、黄单孢菌属(Xanthomonas)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、食酸菌属(Acidovorax)、根瘤菌属(Rhizobium)等近200种植物致病菌，特别适合各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研究用。BIOLOG在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，包括70多种乳酸菌、30多种双歧杆菌及各类常见的食品必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌(含阪崎肠杆菌)、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控制及产品研发等。BIOLOG专门分开提供一个DP(危险微生物)数据库，包含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽假单孢菌)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌等12种强致病微生物，适用于国家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武器检测及防治研究。目前广泛用于美国军方进行生物恐怖检测及预防研究。鉴定初始首先按常规微生物操作方法分离出纯种。鉴定步