动物细胞培养技术

第十二章：动物细胞培养技术•第一节体外培养动物细胞的生物学特征•第二节动物细胞体外培养技术•第三节培养细胞常规检查和特性鉴定•第四节细胞同步化•第五节器官培养动物细胞培养技术动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长，发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培养有很多优越性，但也有不足之处。动物细胞培养已广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，细胞生物学，毒理学和临床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经生产出了多种生物制品，如狂犬病疫苗，干扰素，生长调节素。第一节体外培养动物细胞的生物学特征一、体外培养物的细胞生物学特点（一）生物学特征的两重性1、基本生物学特征与体内细胞相似体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互关系，而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相互关系2、差异性细胞离体后，失去神经和体液调节以及细胞间的相互影响，在体外培养条件下可能会出现分化现象减弱，形态功能单一化，生存一定时间后衰退死亡，出现连续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本机构和功能，也有不同于体内细胞的性状。（二）培养细胞分化状态的改变1、分化在个体发育的过程中，细胞后代的形态和功能上发生稳定性差异过程称为细胞分化。细胞经体外培养后，其原有的功能可能会迅速改变或消失，但其分化能力并未完全丧失。细胞是否分化，关键是在于是否存在使细胞分化的条件，把表皮细胞放在企业界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的胶质细胞，但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧失。2、去分化去分化也叫脱分化是指各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能个性，表现出某种趋同性的过程。二、体外培养细胞的形态当细胞初一较好的培养条件时，形态上有相对的一致性。在一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别，故可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素的影响而发生改变。（一）贴附型细胞和悬浮型细胞1、贴附型细胞（见下图）1）成纤维细胞型2）上皮细胞型3）游走细胞型4）多形细胞型2、悬浮性细胞悬浮性细胞（二）细胞帖壁过程对于贴壁型细胞，在液体环境中生长时，基本呈圆形，当附于支持物表面后，开始仍为圆形，但很快会发生形态上的改变，转变为圆饼形即放射延展细胞。在1/2至2小时后，过渡为极性细胞，可呈纺锤形，三角形或不规则多角形等各种形态。支持物能影响贴附，底物表面不洁不利于贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附，一些特殊物质如LETS，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。（三）接触抑制和密度抑制细胞在体外培养过程中，细胞数量不断增多，生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。三、培养细胞的增殖能力体内细胞生长处于动态平衡环境中，而体外培养细胞的生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养是有限的。当增殖到一定密度时，则需分离出一部分细胞并跟新营养液，否则将会影响细胞的继续生存，这一过程称传代（一）培养细胞生命期、培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。正常细胞在体外培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生存全过程中，基本经历以下三个阶段。1、原代培养基原代培养基也称初代培养基，即从动物机体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃，可见细胞活跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。2、传代期初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长，细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复传代。一般，传代十至五十次左右，细胞增殖逐渐减慢，甚至停止，进入衰退期。3、衰退期衰退期的细胞虽然能存活，但增殖很慢并逐渐停止，进而发生衰退死亡传代细胞由于目中因素的影响，可能发生自发转化，其标志是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获得永久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。转化细胞除了比正常细胞能分裂更多的代数之外，还具有不受细胞密度的影响，不具有接触抑制现象和细胞形状不规则，出现异常染色体的特性。转化后的细胞也可能具有恶性性质。（二）培养细胞“一代”生存期体外培养的细胞当生长达到一定密度后，都需要做传代处理。所谓细胞“一代”是指从细胞接种到分离在培养时的一段时间。它与细胞世代和倍增不同，在细胞一代中，细胞能倍增三至六次。每一代的细胞群体都会经历以下四个阶段：1、潜伏期2、对数生长期3、稳定期4、衰亡期•1、潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中悬浮状态的悬浮期，此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于第五表面上的过程，称为贴壁，悬浮期结束。•细胞贴附于支持物后，要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处于潜伏期可有运动行为，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期和细胞密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代细胞培养细胞潜伏期长，24至96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24h；细胞接种密度大时潜伏期短。•2、对数生长期：当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对数生长期。这是细胞增长最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数MI表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。•MI=（分裂相个数/1000个细胞）×100%•3、稳定期•细胞数量达饱和密度后，细胞逐渐停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养逐渐耗尽，代谢产物积累，ph降低。此时需做分离培养培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至从底物脱落死亡，故传代应越早越好。•4、衰亡期•一个达到稳定生长期的细胞群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率则逐渐上升，以致细胞死亡数逐渐超过新生细胞数，群体中活细胞数下降。（二）原代培养与传代培养1、原代培养原代培养即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。由于原代细胞离体时间短，其原有的生物学特征仍然保持。一般在原代培养时期合适于作药物测试，细胞分化等方面的研究。（1）组织块培养法1）薄层培养法2）翻转干涸法•1、取材修剪冲洗•2、剪切成1mm^3小块•3、移入培养瓶•4、分布组织小块间距5mm•5翻转培养瓶并加培养液37*c静止1~2h•6、翻正培养瓶进行培养•7、原代细胞培养（2）分散细胞培养法1）机械分散法采用一些纤维成分很少的组织进行培养时，可以直接用分散法进行分散。可将组织直接用剪刀剪切，用吸管吸打，这种对组织损伤较大，一般可用注射器针心挤压通过不锈钢网的方法。2）消化分散法使用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞的方法。消化培养法可以将细胞间质包括基质、纤维等去除，是的细胞分散，形成悬液，适用于大量组织的分离。常用的消化液有胰蛋白酶，胶原酶。另外，链酶蛋白酶，黏蛋白酶，蜗牛酶等也可以用于细胞的分化。胶原酶是从细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于分离纤维性组织，上皮组织和癌组织，GaMg和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，作用温和，无须机械振动。其常用量为200iu/ml胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。2、传代培养当细胞持续生长增殖一段时间到达一定的细胞密度后，就应当将细胞分离到新的培养器皿并补充新的培养培养液进行培养，即为细胞的传代培养。在首次培养应注意以下几点：1细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代，2原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见，传代时不同的细胞有不同的传代时间，因而要根据需要注意观察并及时进行处理，3首次传代时细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新的环境而李宇细胞生存和增殖。贴壁细胞的传代大都采用酶消化法来进行。部分贴壁生长的细胞可用直接吹打或离心分离后传代。悬浮细胞可直接传代。•（1）贴壁细胞的消化法传代•（2）悬浮细胞的传代（三）细胞纯化1、自然纯化自然纯化是利用某一细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。2、人工纯化（1）酶消化法：1）先用0，5%胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞，然后再换新的混合液继续消化，之后在导致的显微镜下观察并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。2）吧消化液吸入离心管中，离心去上清，然后移入另一培养瓶中，加培养液置温箱中培养，再向原瓶中也不加新的培养液继续培养。经过几次反复处理，可把成纤维细胞除净。（2）机械刮除法1)标记镜下观察，在培养皿背面圈下上皮细胞生长部位2)刮除弃培养基，把无菌刀深入瓶中，肉眼或显微镜下刮除无标记空间3)冲洗用hank‘s液冲洗1或2次，洗出被挂掉的细胞4）培养然后注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞存留，可重刮除（3）反复贴壁法操作方法与贴壁细胞传代基本相同（4）克隆法（5）流式细胞仪技术（6）其他纯化方法（四）细胞的冻存复苏及运输1、细胞冷冻保存（1）细胞超低温保存的原理细胞在-70*c以下时，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键在于通过-20~0*c阶段的处理过程。在此温度范围内，易造成细胞的严重损伤。如果不加保护直接冷冻，细胞内水分结晶，导致胞内电解质浓度增高，ph改变，部分蛋白质变性，溶酶体膜受损而导致溶解酶释放破坏细胞结构，从而造成细胞死亡。因此，为了减少细胞内的冰晶形成，一般在培养液中加入保护剂以减少冰晶形成和细胞死亡。根据冷冻保护剂是否透过细胞膜可将其分为：1渗透性保护剂2非渗透性保护剂最常用的保护剂为dmso本身对细菌有毒性作用，可自身灭菌。（2）细胞冷冻过程将对数期细胞以等体积20%DMSO培养液重悬，并分装于冷冻管或安培平中，封口，然后降温至4*c30min，冰盒10min，液氮罐气相2h，最后投入液氮中保存。2、冻存细胞的复苏（1）离心法1）取出冷冻管，迅速投入37~40*c水浴中，振荡，使之融化。2）吸入到10ml的培养液中，混悬，离心洗涤1或2次3）取上清加培养液，调浓度为1*10^5~2*10^5个/ml（2）直接铺板法取贮存细胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生长培养集中，进行活细胞计数，密度3*10^5个/ml培养12~24小时，更换新鲜的完全生长培养基，以去除冷冻剂。3.细胞运输1冷冻储存运输2充液法1）选生长良好的细胞，待接近或刚连接成片时去掉培养液，充新培养液，液量达到瓶颈部，拧紧螺帽，保留微量空气；2）妥善包转运送，瓶口用胶带密封，并用棉花等做防震防压处理。3）到目的地后，倒出大部分培养液，仅保留维持细胞生长所需液量，置于37*c培养，次日传代二、动物细胞培养的基本方法（一）悬滴培养法（二）培养瓶培养法（三）培养板培养法（四）旋转管培养法（五）灌注小室培养法（六）克隆培养法六、单细胞分离培养技术主要分为三种，即多孔塑料板克隆细胞法、琼脂培养法和饲养细胞层克隆法1、多孔塑料板克隆细胞法首先将细胞悬液混合均匀，在每孔内加入，0，1ml的细胞悬液。加完后迅速盖好盖板，镜检，记录含有单个细胞的孔。观察时要特别注意孔底边缘，凡不能确认者不要计算在内，用笔标记。然后于co2培养箱进行原代和传代培养。等到培养板孔内细胞增至500~600个时，可以进行分离培养。2、琼脂培养当琼脂凝固时，可以把细胞接种在琼脂表面，生长成克隆后，容易分离，适于做单细胞克隆