引物设计Oligo

单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq点击“window”再点击“Tile”∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。出现Primerpairs窗口，＃代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。关掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原来的窗口，就能看到引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列。至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。当上下游引物全选好以后，首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。blast验证引物进入网页：在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’—3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图：在ChooseSearchSet栏中：Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Humangenomic+transcript或Others(nretc.)。点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：在ChooseSearchSet栏中：Database根据预操作基因的种属定了，本引物可选Humangenomic+transcript或Others(nretc.)。在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：在此界面最下面关键要点击Algorithmparameters参数设置，进入参数设置界面。在GeneralParameters中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。如下图：图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于50-80分，图中④代表这些序列与引物匹配的得分值位于80-120分分值越高，特异性越好。线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与该基因一致。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。Accession、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription、系列的简单描述Totalscore高的就是有两线段间有连线的，如图划线的。Evalue：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【TheEvaluedecreasesexponentiallyastheScore(S)thatisassignedtoamatchbetweentwosequencesincreases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。