搜索
LOGO基因敲除的概念及简史一、二、基因敲除的原理三、基因敲除的应用四、基因敲除的局限性五、展望年代初以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的基因工程途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一、基因敲除的概念及简史1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基因敲除的技术基础1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础1987年，Thompssonetal首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善一、基因敲除的概念及简史二、基因敲除的原理②①基因突变RNAi③同源重组①、RNAi引起基因敲除的机制利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同：逆转录病毒可用于动物细胞的插入；植物细胞中农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。②、基因突变引起基因敲除的机制同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除适用范围：适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞;原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上③、同源重组引起的基因敲除构建与靶基因同源(10～15kb)的载体外显子插有新霉素抗性基因（neor）作为正选择疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择neor和HSV-tk作双重筛选存活的ES细胞将重组体导入ES细胞，体外培养显微注射回交得到X被敲除的动物表型分析③、同源重组引起的基因敲除—真核细胞：ES细胞技术路线乙醇脱氢酶③、同源重组引起的基因敲除—原核细胞：E.coli细胞敲除乙醇脱氢酶基因的步骤：1.同源交换盒载体的构建2.电转化E.coli受体细胞3.筛选4.鉴定用抗四环素作为正选择标记，同时pGEM-3zf质粒本身有氨苄抗性基因。因此，要选择在四环素选择培养基上生长而在含有氨苄的选择培养基中不能生长的细胞。观察被击中细胞的生物学特性，并进行分了生物学检测、可以用特异PCR方法鉴定：以adhE基因两端的同源序列为引物进行扩增重组基因adhE基因经紫外分光光度法测定，重组菌株经诱导表达后，乳酸脱氢酶酶活力为114.8U/ml,比原始菌株乳酸脱氢酶酶活高了3~4倍1、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；2、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学；目前人类基因组研究多由新基因序列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在小鼠上观察该基因的缺失引起的表型变化3、治疗遗传病，即基因治疗；4、改造生物、培育新的生物品种—途径工程中的应用。三、基因敲除的应用例：1989年囊性纤维化病（CF）的致病基因（CFTR）被成功地克隆；1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好的动物模型，得以顺利通过基因治疗的动物实验；1993年开始临床实验并获得成功。途径工程（PathwayEngineering)：利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术原理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。1．提高细胞已有的化学物质的产量；2．产生宿主细胞本身不能合成的新物质；3．扩展细胞的底物使用范围；4．形成降解毒性物质的新催化活性；5．修饰细胞的其它生物学特性。增加了已有物质的量：乙醇脱氢酶基因的敲除随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。四、基因敲除的局限性基因敲除技术在国外已是成熟技术，而国内的技术相对落后，但是国内目前已有许多单位在一领域开展了工作。改造生物、培育新的生物品种，细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着广阔的应用前景。五、展望参考文献：1.刘建忠,敖敬.基因敲除技术研究进展.化学与生物工程，2006,23（2）：4-62.陈其军，肖玉梅等植物功能组研究中的基因敲除技术植物生理学通讯2004，40（1）：121～1263.张文刚，张惠展.大肠杆菌巴豆甜菜碱还原酶基因缺失菌株的构建.华东理工大学学报，2004，30（5）：519-5224.乳酸脱氢酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达，广西大学硕士学位论文5.钱红亮,张惠展.大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆、表达与缺失.微生物学报,2002，42（6）：686-6926.唐雅，张惠展.林可链霉菌中的同源重组.微生物学报，2001，41（5）：559-5667.赵寿元，乔守怡.现代遗传学.北京:高等教育出版社,2001.36-132.8.孙丽萍,吴海珍,张惠展.药物生物技术，2000，7（2）:71-76LOGO