基因文库的建立

第四章基因文库的建立基因文库(genelibrary)基因组文库(genomiclibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)第一节基因组文库的构建一.基因组文库的规模N—基因组文库克隆总数P—所需机率N=f—插入片段与基因组DNA长度之比二．建立基因组文库的一般程序1．载体DNA片段的制备DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段完全酶切ln（1-P）ln（1-f）3.供体与载体DNA连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5.基因组文库质量的评价1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。三.利用质粒载体构建基因组文库BamHIMboIOHPOHHO脱磷酸化重组DNAT4连接酶转化E.coli基因组文库总DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。四.利用λ载体构建基因组文库1.载体DNA片段的制备方法:左右臂DNA片段的获得2.供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法3.重组DNA分子的形成：控制克分子比率，使其形成串状DNA分子4.重组DNA分子的包装1）λDNA的包装物的制备使用的大肠杆菌菌株：E.coliBHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包装蛋白E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-头部蛋白i.两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合----本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。ii.两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。2）重组λDNA分子的包装过程包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化加入重组λDNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片λ颗粒于-70℃保存待用5.基因组文库的扩增包装的λ颗粒感染E.coli培养分离λ颗粒-70℃保存五.利用COS质粒载体构建基因组文库构建过程与λ载体构建过程相似:两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。为提高文库质量，可采取以下措施：1.双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体2.供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排3.载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生载体DNAXhoIorSalI酶切补CT连接重组DNA供体DNASau3AI部分酶切补AG4.采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失AprOricosBHHindAprOricosBHCosHindAprOriBHAprOricosBHCosSalISHHSCosSCosS1BamHISHHSCosSCosS1BamHICosS1BamHIHCosS1BamHICosHCosCosHSSHSSH大片段小片段35-45kbDNA片段T4DNAligaseCosHCosSoriApr利用单COS质粒载体文库SS离体包装感染E.coli利用双COS质粒载体构建基因组文库六.利用P1载体构建基因组文库构建过程也与λ载体构建过程十分相似:1.两臂DNA片段的制备:pAD10sacBBamHI/ScaI2.供体DNA片段的制备:部分酶切蔗糖梯度离心3.两DNA的连接和重组DAN分子的包装1)包装物制备用菌株:E.coliNS3208[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cm-2c1.100am10.1)]:制备pacaseE.coliNS3210[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cmc1.100am131)]:制备头部蛋白2)重组DNA分子的包装与感染与λ重组子包装相似,然后感染E.coliNS3529=E.coliK12recAmcrAΔ(hsdRhsdMmcrBmcrCmrr)(λimm434nin5X1-cre)(λimmλLP1),每微克DNA可在Kanr平板上4X105-2X106Kanr。sacBBamHI+95kbDNAfragmentpacloxPsacBKanDNAheadful++CreRecombi-lationDNAAmplifi-cationpaccleavageproteinloxPAmpAd10pAD10sacBII(29.3kb)XbaIScaIpacloxPlytRepplasmidRepkanrr利用P1载体构建基因组文库七.利用YAC载体构建基因组文库1.两臂DNA片段的制备:pYAC4BamHI/EcoRI脱磷酸化2.供体DNA片段的制备:琼脂糖凝胶-DNA样品的制备EcoRI部分酶切脉冲场凝胶电泳片段回收和纯化3.DNA的连接4.重组DAN分子的转化:原生质体转化法5.转化子的保存:单菌落保存于96孔平板中Sup4CEN4ARS1TRP1OripYAC4ESmSXBXB红色Ura+,Try+转化子菌落脉冲场凝胶电泳酵母人工染色体构建第二节cDNA文库的建立定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。一．cDNA文库的特点1.基因特异性常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA2.器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同4.不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5.各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）3.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同二.cDNA文库的规模N=f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA（mRNA）分子数目之比三.建立cDNA文库的一般程序1.载体DNA片段的制备2.多聚（A）RNA的分离与纯化3.双链cDNA的合成1）单链cDNA的合成：反转录法2）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子ln(1―p)ln(1―f)2）同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接3）cDNA的定向插入5.重组cDNA分子的转移和文库的建立选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为λ载体，则需进行体外包装、感染等。4.ds-cDNA与载体DNA相连1）人工接头：要求具平端ds-cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂与载体相连12人工接头II人工接头IREIREII与载体相连3重组cDNA甲基化酶TdTdCTPREcDNA文库的构建ds-DNA合成与SalI匹配接头相连NotI酶切1)SalI/NotI2)T4DNAligaseNotIprimer/adaptorcDNA重组子载体SalIadaptorcDNA的定向插入四.建立cDNA文库的特殊方法1.Okayama–Berg法1）T引物的合成：在质粒上进行，用于合成第一条cDNA链2）G引物的合成：在质粒上进行，用于合成第二条cDNA链3）第一条cDNA链合成：T引物与mRNA退火反转录反应4）第二条cDNA链的合成：a.第一条cDNA链3’-末端加尾（dCTP）b.限制酶切除去载体上所加的多聚C尾巴c.与G引物退火d.除去RNAe.合成第二条cDNA链5）cDNA文库的形成—转化该法的优点：获全长cDNA，并使cDNA表达的可能性提高一倍，因为cDNA插入方向与载体上启动子方向一致。pUC19SISmPH1)SacI2)TdT+dTTP1)PstI2)TdT+dGTPEESmPH1)SmaI2)分离大片段1)HindIII2)分离小片段退火碱解退火连接TdT+dCTP2)分离大片段1)HindIIIKlenow片段+dNTPT4ligaseAMV-RT+dNTPEPHTTTTGGGGCCCCTTTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAATTTTGGGGCCCC5'GGGGCCCCGGGGOkayama-BergcDNA文库构建1)PstI2)TdT+dGTPSmaI退火GGGGGGGGGGGGPolIK+dNTPT4DNAligaseTTTTAAAACCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGTTTTAAAATTTTAAAATTTTAAAAAAAAAAAACCCC碱解(dT)12-18AMV-RTdNTPUC192.Okayama–Berg改进法该法集中了常规方法和Okayama–Berg法的优点，第一条cDNA链合成用常规法，但在3’-端加尾后，其余步骤与Okayama–Berg法相同3.SMART(SwitchMechanismAtthe5’endofRNATemplates)方法1)当反转录酶合成到mRNA模板5’端后，它会在第一链的3’端加上几个C；2)合成的寡核苷酸G与C配对；3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第二条cDNA链；4）LDPCR—LongDistancePCRcDNALibraryConstructionKitGGGCCCpolyALDPCR(50ngoftotalRNA)PCR-SelectcDNAsubtractionEnrichedfull-lengthdscDNASfiIdigestionSfiIASfiIBleftarmrightarmSfiIASfiIBPackagingprimerextension(1gofpolyARNA)μ+Fractionation&ligationintoλTripIex2armsTM51SMARTMethodGGGPolyA+RNAPolyAModifiedoligo(dT)PrimerFirst-strandsynthesiscoupledwith(dC)tailingbyRTGGGpolyATemplateswitchingandextensionbyRTGGGCCCpolyAAmplifycDNAbyLDPCRHigh-qualitydscDNAcDNAlibraryconstructionVirtualNorthernbolts5131CDNAlibraryInTripIEx2λ5151CCC4．聚合酶链式反应法（PCR法）1)引物的合成：T引物—5’-端富含GC，可提高退火温度，避免非特异性变性发生，因为3’-端含低聚dTG引物—5’-端富含AT，便于与载体相连，3’-端含低聚dG2)cDNA的PCR扩增：采用TaqDNA聚合酶，方法是：变性与引物复性链延伸下一个循环3)cDNA连接方式：用匹配接头3'PCR法构建cDNA文库