PCR引物设计原理

PCR引物设计原理PCR反应一般由三个步骤组成：①模板的热变性；②引物复性到单链模板上；③热稳定DNA聚合酶催化的延伸变性在应用TaqDNA聚合酶进行PCR时，变性温度在94-95℃下进行，这也是TaqDNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。有时把变性时间设计为5min，以便大分子模板DNA彻底变性的概率。对于GC含量为55%或更低的线性DNA模板，推荐PCR的变性条件是94-95℃变性45s。•复性温度（退火温度）至关重要！！！•退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；•退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；•退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低3-5℃下进行。•最好通过对复性温度比两条引物的Tm值低2-10℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。引物和模板DNA的复性•对TaqDNA聚合酶来说，最适温度为72-78℃，时间约为1min。引物的延伸与循环数目•哺乳动物DNA为模板时，至少进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为30-33个循环。引物设计要点（1）碱基组成：•GC含量应在40%-60%（45%-55%）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；（2）引物长度：•引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。（3）重复或自身互补序列：•形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。（4）上下引物的互补性：•一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。•当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。（5）解链温度（Tm值）：•计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般为50-70℃。•这些特性保证了扩增产物在每一个PCR循环可有效变性。（6）3’末端3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。•当末端碱基为A时，错配时引发链合成的效率大大降低；•当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般PCR反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。•引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位点：一些概念•有意链（Sensestrand），正义链（positivestrand），编码链（codingstrand）；无意链（anti-sensestrand），负义链（negativestrand），模板链（templatestrand）•正向引物（forwardprimer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从5’→3’方向读出DNA正链的序列。•反向引物（Reverseprimer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出DNA负链从下游到上游的反向序列。PrimerPremier5.0软件设计引物•是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件•主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和Motif正向（Asis）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reversecomplemented）。正向（Asis）反向（reversed）互补（complemented）Enzyme•软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq或Map，分别以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。MotifPrimer点击Search，进行引物搜索Searchcriteria窗口：多种参数可以调整。PrimerLength常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。Manual→Searchparameters→人工搜索参数设置窗口。Searchstringency应选High。GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以。Searchprogress窗口中显示SearchCompleted→OK键结果窗口→有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。该图分为四部分：最上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！！第四层：四种重要指标的分析引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27nt。Tm融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链温度。PCR反应的合适Tm范围为56-63℃（50-70℃）GC%含量：对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适。（40-60%,45-55%）Degeneracy多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免3’末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。BLAST验证引物•进入点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项•在EnterQuerySequence栏中输入引物序列：•例：引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’•同时输入上下游引物。输入上下游引物都从5’→3’。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物。•在ChooseSearchSet栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Humangenomic+transcript或Others•在ProgramSelection中：选择Somewhatsimilarsequences(blastn)项，如下图：•在此界面最下面关键要点击Algorithmparameters参数设置，进入参数设置界面。•在GeneralParameters中：Expectthresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框将数字改为7。•图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription序列的简单描述高的就是有两线段间有连线的代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，也就是说序列完全匹配了。比对到的序列长度E值越小为好！！匹配上的碱基数占总序列长度的比例缺失或插入，用“-”来表示Query1、2表示输入的两对引物，Sbjct表示在库里比对的序列PrimerBLAST的详细结果ncbi在线primer设计默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。用Oligo软件设计/评估PCR引物•启动Oligo，选择File→open，打开要进行引物分析的序列。图中显示的三个指标：Tm值、ΔG和Frequencies。退火温度窗口是设计引物的主窗口，其他两个具有辅助作用。因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为Tile方式。用Tile方式显示窗口Tm，退火温度窗口Tm值曲线以选取72℃附近为佳；5’到3’端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。圈出来的序列部分及黄色的bar即代表当前分析的21个碱基的Tm值可点击窗口的左下角的Upper、Lower按钮选择上游引物、下游引物。Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了显示了装载的整个序列的6-7mers寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的3'端如果在一个特定的数据库（GenBank的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。Frequencies，碱基频率窗口如果选择出现频率较低的位点作为3'末端，那么就减少了在复杂的底物（比如整个基因组DNA）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性PCR产物的形成。平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。ΔG，序列内部碱基稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反应了序列与模板的结合强度；最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能ΔG表示。dAdCdGdTdA-1.9-1.3-1.6-1.5dC-1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9第二个核苷酸第一个（5’）核苷酸例子：双链d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。3’末端序列ΔG太高。你可以在三个窗口中自行设计引物。选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。对你设计的引物质量进一步分析。同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。•参数设置与搜索选择search→forprimersandprobes，进行如右图设置。•点击searchranges，设置引物范围和PCR产物的大小•点击parameters，进行参数设置。因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatiblepairs默认下，对引物的要求：无二聚体、3’高度特异、GC%含量有限定、去除错误引发引物等。引物的长度及产物的长度设置。PrimerLength设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要;PCRProductsize最好是100－500bp