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PCR扩增目的基因制作人：江乐明【PCR原理】聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。反应包括:变性(Denature)、退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理延伸变性、退火5’3’5’3’3’5’变性退火3’5’延伸变性：加热，使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。退火：溶液温度降至45～65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。PCR的三个热反应过程温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。PCR的产量每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。DNA产量以指数上升，n个循环后，达到2n拷贝。【仪器耗材与试剂】（一）仪器与耗材1.PCR热循环仪2.20μL、200μL吸头，200μL、500μLEP管，10μL、50μL、200μL移液器3.PCR电泳仪和电泳槽（二）试剂1.10×PCRBuffer；2.MgCl2,25mmol/L；3.dNTP（其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为10mmol/L）；4.正向引物与反向引物（10μM/L）；5.TaqDNA聚合酶（1U/μL）；6.DNA模板（小鼠基因组DNA，100ng/μL，反转录cDNA）；7.ddH2O【实验步骤】1.在0.2mLEppendorff管内配置20μL反应体系：反应物体积（μL）ddH2O12PCR缓冲液（10×）2MgCl2（25mmol/L）2dNTP（10mmol/L）1.0正向引物（10μM/L）0.5反向引物（10μM/L）0.5TaqDNA聚合酶1模板DNA12.按下述程序进行PCR扩增:1）94℃预变性3min；2）94℃变性1min；3）55℃退火30sec；4）72℃延伸30sec；5）重复步骤2~4,34次；6）72℃延伸5min；7）4℃,3min.3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制2％琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。4.PCR的反应体系中各组分作用•DNA模板(template)•引物(primer)•4种脱氧核苷酸（dNTP）•DNA聚合酶（Taq）•反应缓冲液•Mg2+及某些使酶稳定的辅剂质量：要求有较高纯度的DNA样品避免反复冻融，防止降解数量:25-100ng/20µl1）DNA模板2）引物与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链DNA片段。3）dNTP4种dNTP用量应均衡，否则会减少Taq酶合成的忠实性，增加错配率。最初的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶klenow片段,不耐热，每次加热变性后需重新补加。聚合温度偏低（37℃），产生非特异性扩增TaqDNA聚合酶从水生栖热菌中分离，可在70-75℃生长。Taq酶扩增效率:600bp/min错配率:1bp/4000bp(无3’-5’外切酶活性)4）DNA聚合酶作用:增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增加dsDNA的Tm值，提高融合温度。与游离dNTP形成可溶性复合物，有利dNTP渗入。浓度:1.5-2.0mmol/l5）缓冲液中的Mg2+6）循环次数循环次数是25－35次。循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增加。5.PCR反应常见问题1.没有任何产物：•模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）•酶失活或者忘记添加•引物设计，浓度•Mg2+浓度太低•变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等2.产生多个条带：•引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高•Mg2+浓度太高•酶用量太多•退火温度过低等3.产生与目的片段长度相似的非目的片段:模板或者试剂不纯，有其他基因组污染4.出现片状拖带：模板，酶，dNTP用量太大，循环次数过多谢谢！