PCR扩增实验

聚合酶链式反应（PCR）（以酵母菌16SrRNA序列扩增为例）食品微生物实验实验目的了解PCR反应原理熟悉PCR反应流程掌握PCR基本实验操作及步骤掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法实验原理PCR概述PCR原理PCR的特点PCR反应过程琼脂糖凝胶电泳聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。以双链DNA为模板，由引物介导，在DNA聚合酶作用下，扩增目标基因片段。PCR原理DNA的半保留复制进行复制。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外扩增。DNA体内外扩增条件对比模板原料酶能量引物DNA体内扩增基因组4种dNTP解旋酶DNA/RNA聚合酶连接酶ATP提供3`端羟基的RNA片段DNA的PCR扩增目的基因或DNA片段4种dNTPTaq酶（耐热DNA聚合酶）热能上下游引物（单链DNA）其他体内环境缓冲液、Mg2+PCR的特点特异性强PCR特异性决定因素：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测灵敏度达3个RFU细菌最小检出率为3个细菌快速、简便一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100ul标准的PCR反应体系1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应过程适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上单链与引物复性DNA变性形成二条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增琼脂糖凝胶电泳PCR反应后，需要对反应产物进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法；“分子筛”和“电泳”双重作用；琼脂糖凝胶网使分子通过时会受阻，大分子在涌动受阻力大；因此在电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小；核酸分子带负电，电泳时从负极向正极涌动。分子量较大的核酸涌动较慢，反之较快；DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小试剂：2×TaqPCRMasterMix（包含dNTP、Mg2+、Taq聚合酶、缓冲液等）、酵母菌16SrRNA上下游引物（up\downprimer）、ddH2O、酵母菌DNA模板、琼脂糖、GlodenView；缓冲液：50×TAE缓冲液；仪器：PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统；材料：EP管、枪头、微量移液枪、制胶板、梳齿。实验材料1、在EP管中，按下述体系依次加入PCR试剂及模板：2×TaqPCRMasterMix10ulddH2O8ulDNAtemplate1ul16SrRNAup\downprimer各0.5ul2、将加好样的EP管放入PCR仪器，按下述程序进行反应：94℃5min；94℃15s，56℃20s，72℃30s，30cycle；72℃8min；25℃∞实验步骤TotalVolume20ul3、将50×TAE缓冲液稀释到1×TAE，备用；例如：配置500ml1×TAE，需要50×TAE10ml，加蒸馏水490ml；4、用1×TAE配置浓度为0.8%~1%琼脂糖凝胶例如：配置100ml琼脂糖凝胶即加入100ml1×TAE,0.8g琼脂糖；5、在琼脂糖凝胶中加入glodenview（5ul/100ml）；实验步骤实验步骤6、将适量琼脂糖凝胶注入制胶槽，插入梳齿，冷却凝固；7、待PCR反应完成后，在电泳槽中加入适量1×TAE，以放入琼脂糖凝胶后，刚好没过胶孔为宜；8、将扩增产物加入胶槽，同时加入Marker；9、将琼脂糖凝胶放入电泳槽，在90V电压下电泳30~60min；10、电泳完成后，用凝胶成像系统观察记录结果。THEEND••