微生物-金黄色葡萄球菌

金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系一、生物学特性——菌体形态及培养特征革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系大多数菌株最适生长温度30-37℃，最适pH为7.0-7.5；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系生物学特性——致病性金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶）e.肠毒素：引起急性胃肠炎。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系葡萄球菌皮肤感染金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系二、检验程序与操作方法根据中华人民共和国国家标准：《食品卫生微生物学检验》GB4789.10-94金黄色葡萄球菌检验金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水国标：金黄色葡萄球菌检验程序直接计数方法增菌培养方法Baird-parker（贝尔德-帕克）0.3ml、0.3ml、0.4ml7．5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤血平板血平板，Baird-parker涂片染色观察溶血血浆凝固酶试验报告36±1℃24hr36±1℃24hr36±1℃24hr金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系检验程序——增菌培养利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5%氯化钠肉汤增菌。置37摄氏度培养箱培养24小时。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系检验程序——分离培养血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系血平板制作成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。制法：加热融化琼脂，冷至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系BP（贝尔德-帕克）平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。检验程序——分离培养金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系在BP平板上典型菌落为：灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系B-P平板金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系革兰氏阳性，球形，组成葡萄状检验程序——鉴定之革兰氏染色镜检金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系检验程序——鉴定之凝固酶试验金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。方法一：试管法吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃恒温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系试管法金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系阳性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系有凝块血浆均匀混浊生理盐水方法二：玻片法在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10~20s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系兔血浆制备成分：柠檬酸钠0.106mol/L（31.3gNa3C6H5O7·2H2O溶于1L蒸馏水中）制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系葡萄糖肉浸液肉汤的制备成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6。制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH，煮沸并过滤、分装，121℃30min高压灭菌。金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系25g样品+225ml生理盐水5mL样品匀液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉汤血平板36±1℃24hr镜检与肉浸液肉汤培养血浆凝固酶试验报告结果定性检测36±1℃24hr36±1℃24hr36±1℃6hrBP平板金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系25g样品+225ml生理盐水选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别记录每种类型的菌落数）36±1℃48hr血平板、镜检与肉浸液肉汤培养血浆凝固酶试验报告结果金葡菌数/g(mL)定量检测（平板法）每种类型选取一个菌落36±1℃24hr36±1℃6hr适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品计算办法：（三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加）×血浆凝固酶阳性数÷5×稀释倍数梯度稀释金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系第一天器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种上午：准备的器材第一天下午规格名称数量1、样品处理：鱼干、腊肉2、增菌培养3、BP平板制备及分离接种4、采集兔血的准备：抗凝剂制备、灭过菌的容器和玻璃珠250ml三角瓶1个10×100mm试管6支1ml移液管2支10ml移液管2支直径为90mm平皿8套250ml量筒1支金色葡萄球菌检验食品安全检验技术（微生物部分）闽北职业技术学院食品与生物工程系第二天接种选择性平板进行分离培养和玻片法血浆凝固酶试验1、血平板制备及兔血浆制备2、接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于血平板或B－P平板。3、培养放于36±1℃培养24h。4、玻片法血浆凝固酶试验第三天观察分离结果、镜检和葡萄糖肉浸液肉汤制备及接种第四天血浆凝固酶试验（试管法）、实验报告