大肠杆菌的培养和分离

微生物的利用第一部分特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物原核生物界原生生物界真菌界病毒界基础知识：微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称．单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。☆菌落实验目的1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。实验一、大肠杆菌的培养和分离实验流程培养基成分及其作用成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水(生长因子)调节促生长维生素，AA，碱基等另外还需要满足微生物生长对pH、温度、渗透压等的要求。培养基的类型分类：液体培养基物理状态固体培养基半固体培养基选择培养基功能鉴定培养基琼脂（扩大培养）（分离、鉴定、计数、保存菌种）1．计算、称量LB固体培养基的配制2．溶化•3．调pH：pH7．6•4.分装、加塞、包扎5．灭菌:6．倒平板:待培养基冷却到60℃左右时，在酒精灯附近倒平板7．无菌检查：37℃恒温培养箱中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。灭菌操作目的：所利用的微生物不被其他杂菌污染，成功地培养微生物的关键。消毒：杀灭部分微生物（1）无菌操作：消毒与灭菌的区别灭菌：杀灭所有微生物，包括芽孢，孢子1器皿无菌操作2培养基3操作高压蒸气灭菌：121℃（1kg/cm2）15min.1器皿2培养基(1)含葡萄糖：高压蒸汽灭菌法（90℃（500g/cm2）30min）(2)含尿素：G6玻璃砂漏斗过滤灭菌3操作超净台：紫外灯，过滤风手：酒精消毒接种环：灼烧灭菌玻璃刮刀灼烧灭菌请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。1（二）分离大肠杆菌接种方法有：划线分离法涂布分离法微生物的接种技术：划线分离法每次划线之前都要灼烧接种环1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？问题讨论（1）第一步灼烧是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；（2）每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，分散得到单个细菌，获得单菌落。（3）划线结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；3.为什么要轻轻的划线，不能划破培养基涂布分离法配制培养基灭菌倒平板接种37℃恒温培养箱倒置培养4℃冰箱菌种保存大肠杆菌的培养和分离实验流程菌种扩增•37℃摇床震荡培养12h（于LB液体培养基中）菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。2.为什么要在酒精灯火焰旁操作？答：酒精灯火焰旁有无菌区域3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。分析与讨论:3、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？完成实验后，所有接触过细菌的器皿都必须先经过高压灭菌后再洗涤，特别是培养基有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体会影响人畜健康，也会污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要经过高压灭菌后再丢弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤30min，再永清水洗净，仍可再用。封口膜也可重复使用。例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（）A.防止杂菌污染B.接种前菌种要进行灭菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前B（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养。（4）表中营养成分共有类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分。固氮微生物3调整pH依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）