51细胞化学染色

细胞化学染色实验一、过氧化物酶(PeroxidaseStain，POX)染色【目的和原理】细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解，产生新生态氧。后者将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，进而形成棕色化合物沉淀于酶的所在部位。【器材和试剂】1．第一液联苯胺0．3g360g／L亚硝基铁氰化钠饱和液lml95％L醇加至lOOml贮存于棕色瓶中，可保存一年。小瓶分装备用。2．第二液(稀过氧化氢液，新鲜配制)3％过氧化氢0．3ml蒸馏水25ml【步骤和方法】1．于新鲜干燥血涂片或骨髓涂片上，滴加第一液5--8滴，使盖满整个血膜，作用1--2min.2．滴加等量的第二液，混匀，染4--8min。3．勿倾去染液，直接用水冲洗。4．干燥后再用瑞氏染液复染。【结果】在细胞的胞浆中出现蓝色或蓝棕色颗粒为阳性反应。1．阳性反应强度的判断：阴性：无颗粒。弱阳性：颗粒小，分布稀疏。阳性：颗粒略粗，分布较密集。强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。2．粒细胞系统：早期原始粒细胞阴性，晚期(分化好)原始粒细胞以下各阶段呈阳性，粒细胞越成熟POX反应越强。但衰老的中性粒细胞酶活性降低，反应程度减弱，甚至呈阴性反应。嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色，嗜碱性粒细胞阴性。3．单核细胞系统：除早期原始阶段外皆呈弱阳性反应。其颗粒细小，弥散分布，可覆盖核上，有的也可呈阴性反应。4．正常网状细胞(分化型)及吞噬细胞：可呈不同程度阳性反应。5．淋巴细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞系统等：均为阴性。6．Auer小体：呈阳性。【临床意义】POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(简称急粒)、急性单核细胞白血病(简称急单)、急性淋巴细胞白血病(简称急淋)类型的重要细胞化学方法。1．急性粒细胞白血病：细胞分化较好时，原始粒细胞呈阳性反应，阳性率可30%，在分化较差的白血病，如AML-M0和未分化型（AML-M1）的部分病例，原粒细胞的POX染色也可呈阴性。2．急性早幼粒细胞白血病时白血病细胞呈强阳性反应。3．急性淋巴细胞呈阴性反应，FAB分型规定POX阳性率3％。4．急性粒单细胞白血病：原始细胞POX染色多呈阳性，阳性率一般20%，但难于区分原粒和原单时可进一步作酯酶染色鉴别。5、急性单核细胞白血病：原单和幼单POX多呈弱阳性或阴性，单核细胞呈弱阳性，阳性率常3%，阳性颗粒较为细小、稀疏。6、中性粒细胞髓过氧化酶缺陷症：中性粒细胞POX染色，纯合子呈阴性，杂合子多为弱阳性。在一些髓系细胞白血病，如部分慢性髓细胞白血病（CML）患者，中性粒细胞POX染色可呈阴性或弱阳性，提示POX获得性缺陷。【注意事项】1．过氧化氢必须新鲜配制。过氧化氢的最适浓度是0．05mol／L左右，浓度过高，反而抑制酶作用。一般采用5ml蒸馏水，加3％过氧化氢一滴。若用30％的过氧化氢时，只能在100ml蒸馏水中加1～2滴。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。2.染色时稀释过氧化氢之后必须与联苯胺液充分混合，否则同一涂片细胞染色情况不一致。【评价】POX染色是鉴别急性白血病类型最常用的细胞化学染色方法。但若原始细胞均呈阴性（阳性率3％），并不能肯定是急性淋巴细胞白血病，因为分化较差的白血病性原粒细胞、原单细胞、原巨核细胞、原淋巴细胞均可呈阴性，此时应结合其他细胞化学染色、细胞免疫表型分析等进行鉴别。二、铁染色(IronStain)【目的和原理】骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。【材料】1.酸性亚铁氰化钾溶液取200g／L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓滴加浓盐酸，边滴边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加200g／L亚铁氰化钾溶液，亦边滴边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。2．2g／L核固红-硫酸铝溶液取硫酸铝2g溶于100ml蒸馏水中，再加入核固红(Emerk出品)0.2g。置37℃水浴中1h并随时振荡，使溶解，过滤后使用。【步骤和方法】1.选骨髓小粒丰富的骨髓片，用甲醇固定10min，待干。2．玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，染色30min(可置37℃环境)3.用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10—15min。4．流水冲洗、待干、镜检。【结果】(1)幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。(2)细胞外铁：用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。(-)：无颗粒(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁珠)。(++)：有较多的铁颗粒和小珠。(+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。(++++)：有极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。(3)细胞内铁：用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。并根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型：I型：幼红细胞内含铁粒1--2粒；Ⅱ型：幼红细胞内含铁粒3-5粒；Ⅲ型：幼红细胞内含铁粒6—10粒；Ⅳ型：幼红细胞内含铁粒10粒。(4)环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6粒以上，其中2／3以上的铁粒围核成完全或不完全性环形(围核1／2以上的区域有铁粒环绕)。【临床意义】1．参考值细胞外铁+--++(2／3人为“+”，1／3人为“++”)。细胞内铁阳性率为19％--44％，平均21．4％，以I型为主，少数为Ⅱ型，所见铁粒较细而浅染，散在分布，一般位于胞浆的外侧，Ⅲ及Ⅳ型以及环形铁粒幼红细胞少见。2．鉴别缺铁性贫血及某些溶血性贫血。缺铁性贫血骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞阳性率0--28％，平均3．4％，所见铁粒极细少而着色浅，以I型为主，Ⅱ型者极少见，Ⅲ型以上者不见。3．用于诊断铁粒幼红细胞性贫血这时能找到数量不等的环型铁粒幼红细胞，并多见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼红细胞。【注意事项】1．玻璃片需经无铁处理将新片经清洁液浸泡24h，取出反复水洗后浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡在5％盐酸中24h，用双重蒸馏水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。2．酸性亚铁氰化钾液须新鲜配制。3．水洗时勿在水流下猛冲，以免髓粒脱落。