DNA提取纯化

Chapter3DNA的提取与纯化基因工程需要三种不同的DNA:全细胞DNA(总DNA,totalcellDNA)质粒DNA噬菌体DNA学习内容：制备细胞总DNA–培养、搜集细菌细胞–制备细胞提取物–DNA纯化、浓缩质粒DNA提取–根据分子大小分离–根据结构分离–质粒扩增提取噬菌体DNA–噬菌体的培养、收集、纯化–纯化M13DNA1.制备总DNA基本步骤：1)培养、收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基(确定成分培养基)：g/LNa2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)葡萄糖(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基(不确定成分培养基)：g/Ltyptone(10)提供氨基酸以及肽段Yeastextract(5)提供氮源、糖类、有机和无机营养NaCl(10)1.1培养、收集细菌细胞37°C，150-250rpm培养10小时左右。达到最大浓度2-3×109cell/ml。600nm下的OD值，1OD相当于0.8×109cell/ml。Harvestingbacteriabycentrifugation1.2制备细胞提取物利用溶菌酶、EDTA或两者结合。–溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，能消化细胞壁的多聚物。–EDTA络合保持细胞结构完整的钙离子，也可以抑制DNA酶的活性。–提取液中同时还加入SDS，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解。Preparationofacellextract.Preparationofacellextract1.3DNA的纯化去掉DNA以外的成分蛋白酶K/苯酚——蛋白质RNA酶——RNARemovalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆PurificationofDNAfromacellextractDNA的浓缩最常用的浓缩方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子的条件下）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀（杂质）。1.4DNA的浓缩以及浓度、纯度的测定1.4DNA的浓缩与浓度、纯度的测定DNA浓度的测定260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml（40μg单链DNA或RNA/ml）。电泳检测核酸具有结合染料的能力溴化乙锭Ethidiumbromide,EtBr,EBEB与DNA结合的多少与DNA分子的大小及其分子的数目成正比，因此荧光强度的大小可所反映DNA片段的大小及其数量。DNA浓度的测定琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖(Agarose)是从海藻中提取的一种线状多糖高聚体。琼脂糖凝胶电泳的制备和检查配制缓冲液等配制琼脂糖凝胶装备电泳装置核酸上样核酸迁移观察TAETBETPE琼脂糖凝胶电泳的制备和检查溴酚兰作用？琼脂糖凝胶电泳的制备和检查P102电泳检测1.4DNA的浓缩与浓度、纯度的测定DNA纯度的测定A260/A280=1.8，1.8表示含有酚或蛋白质，1.8说明有RNA。Theuseofananion-exchangechromatographyresininDNApurification.DNA的纯化—离子交换层析法P1011.5植物总DNA的提取CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂，CTAB在低盐浓度下与核酸结合，在高盐浓度下又与核酸分离。适用于糖、脂含量较高的植物。SDS法(十二烷基磺酸钠)去污剂，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解CTAB法提取植物DNA2质粒DNA提取根据质粒DNA的大小（质粒分子最大不超过大肠杆菌染色体的8%）根据DNA的构造◇碱裂解法Alkalinedenaturation◇EB—CsCl密度梯度离心法Ethidiumbromide-caesiumchloridedensitygradientcentrifugation2质粒DNA提取2.1根据分子大小提取质粒DNA在蔗糖存在时用EDTA和溶菌酶处理，可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整；用非离子去垢剂如TritonX-100处理，诱导细胞裂解；离心分离，小分子质粒位于裂解液上清；而细菌大分子DNA则沉淀下来。2.1根据分子大小提取质粒DNA问题：–裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA。–质粒分子非常大时，将与细胞残留物共沉淀。2.2根据分子构造提取碱裂解法在非常窄的pH范围内，非超螺旋化的DNA会变性，而超螺旋化的质粒DNA不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.0~12.5，破坏氢键，使非超螺旋化的DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。同时利用SDS裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。上清液中只剩下超螺旋化的质粒DNA了。Plasmidpurificationbythealkalinedenaturationmethod.AlkalinedenaturationI型：超螺旋环状II型：带切口环DNA分子的构象P102CircularformsofDNAmigrateinagarosedistinctlydifferentlyfromlinearDNAsofthesamemass.Typicallyuncutplasmidswillappeartomigratemorerapidlythanthesameplasmidwhenlinearized.Additionally,mostpreparationsofuncutplasmidcontainatleasttwotopologically-differentformsofDNA,correspondingtosupercoiledformsandnickedcircles.Theimagetotherightshowsanethidium-stainedgelwithuncutplasmidintheleftlaneandthesameplasmidlinearizedatasinglesiteintherightlane.2.2根据分子构造提取EB—CsCl密度梯度离心法在较大的离心力条件下，CsCl形成梯度，生物大分子形成不同的条带，条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。CsCldensitygradientcentrifugation.CsCldensitygradientcentrifugationPartialunwindingoftheDNAdoublehelixbyEtBrintercalationbetweenadjacentbaseparirs.EBEB如何与DNA结合?2.2EB—CsCl密度梯度离心法EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，线形DNA大约会降低0.125g/cm3；但超螺旋的DNA结合EB少，浮力密度降低较小，仅降低0.085g/cm3。EB可以用丁醇抽提。CsCl可以用透析除去，纯度可达100%。PurificationofplasmiodDNAbyEtBr-CsCldensitygradientcentrifugation如何分离质粒DNA？2质粒DNA提取2.3质粒扩增一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。Plasmidamplification●PlasmidamplificationInhibitorofproteinsynthesis:Chloramphenical,12h,3噬菌体DNA的制备当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010λ噬菌体，但只能产生500ngDNA。3噬菌体DNA的制备3.1噬菌体的培养自然培养的λ噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外λ噬菌体，必须经过诱导培养使所有的λ噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放λ噬菌体。3.1噬菌体的培养大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cI突变体中，cI基因在30°C条件下正常表达，在42°C时，不能正常表达，产生溶菌性。Inductionofaλcllysogenbytransferringfrom30℃to42℃LysogenicλphageAt30℃,clgeneproteinworks,Keeplysogeny:At42℃,clgeneproteindoesnotwork,produceextracellularphage.Achievingtherightbalancebetweencultureageandinoculumsizewhenpreparingasampleofanon-lysogenicphageNon-lysogenicλphage（Lytic)由于缺失修饰，大多数基因工程载体属于此类型。3噬菌体DNA的制备3.2噬菌体的收集噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集λ噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。Collectionofphageparticlesbypolyethyleneglycol(PEG)precipitationCollectionofphageparticles3噬菌体DNA的制备3.3从λ噬菌体中纯化DNAPEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的λ噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。PurificationofλphagePurificationofλphageparticlesbyCsCldensitygradientcentrifugation.3.4纯化M13DNA每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体。由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要CsCl梯度离心。PreparationofM13DNAfromaninfectedcultureofbacteria.PreparationofM13DNA