HA与HI实验

实验HA与HI一、实验原理某些病毒（如新城疫病毒，减蛋综合症）能凝集某些动物的红细胞，这种现象虽非抗原抗体，但利用这一现象可检查样品中是否有病毒存在，测病毒滴度，病毒红细胞血凝由于能被相应抗体所抑制，因此可以通过病毒的血凝抑制试验测定抗体的效价。二、实验试剂与器材1、实验器材小烧杯、电子天平、离心机、离心管、采血针、玻璃棒、微量移液器（50µl）、枪头（50µl）、培养皿、96孔板恒温箱2、实验材料免疫过的鸡3、实验试剂3*10.9%生理盐水（200ml）称取1.8gNaCl,溶解于200ml蒸馏水中，即可制成3*21%红细胞配制（1）、取抗体凝血，离心（1000~1500rpm,5min）（2）、弃上清，取5ml生理盐水，离心（1000~1500rmp,3~5min）（3）、弃上清，取5ml生理盐水，离心（3000rmp,3~5mim）（4）、以红细胞体积，加入生理盐水，制成1%浓度3*3抗体制备（1）、从鸡翅取血，放入离心管中（2000rmp,3~5min）（2）、吸取上清，即为抗体（黄色清亮）3*4抗原制备（1）、取新城疫病毒干粉，加生理盐水（灭菌过））、（2）、溶解，即为抗原三、实验步骤1、HA实验步骤（1）、前10孔与第12孔，每孔加50µl生理盐水（2）、第11孔加50µl病毒液，第12孔不加，前10空依次倍比孔口项目123456789101112稀释液50505050505050505050不加50病毒液50→50→50→50→50→50→50→50→50→50，弃5050不加病毒液稀释倍数1：21：41：81：161：321：641：1281：2561：5121：1024阳性对照阴性对照红细胞505050505050505050505050作用时间与温度放37℃恒温箱20min结果凝集凝集凝集凝集凝集凝集凝集不凝不凝不凝凝集不凝（3）、每孔加入50µl红细胞（4）、放37℃恒温箱20min，观察结果2、HI实验步骤（1）、四单元抗原：取病毒滴度2^n/2^2,则取1ml抗原液，加入2^(n-2)—1ml生理盐水。(2)、前10孔与第12孔每孔加入50µl生理盐水，第11孔50µl生理盐水孔口项目123456789101112稀释液50505050505050505050不加50被检抗50→→→→→→→→→50，50不每孔50µl生理盐水病毒倍比稀释1250µl1150µl1050µl150µl弃50µl……50µl50µl50µl50µl病毒液50µl生理盐水50µl病毒液（3）、第11孔加入50µl抗体，前10孔倍比稀释（4）、每孔加入50µl四单位抗原（5）、放37℃恒温箱15min（6）、每孔加入50µl1%细胞（7）、放37℃恒温箱15min体5050505050505050弃50加血清稀释倍数1：21：41：81：161：321：641：1281：2561：5121：1024阳性对照阴性对照4单位抗原505050505050505050505050作用时间与温度放37℃恒温箱15min红细胞505050505050505050505050作用时间与温度放37℃恒温箱15min结果不凝不凝不凝不凝不凝不凝不凝不凝不凝凝集不凝凝集121101150µl50µl50µl弃50µl……50µl抗体l每孔50µl生理盐水50µl抗体50µl生理盐水抗体的倍比稀释（8）、取出观察，记录抗体效价四、实验结果与分析1、HA实验结果与分析（1）实验结果第7孔（2）分析①第3排，第7列红细胞下滑可能是由于洗板的问题2、HI实验结果与分析(1)实验结果第9孔（2）实验分析①取血清时，鸡的血脂太高，或者是由于该鸡血液中蛋白质含量偏高、血清黏稠，离心后不易分离。②第7排，第9列红细胞有点凝集可能是红细胞没有混匀注意事项（1）1%红细胞配制时洗涤干净并且转速要合适，过高过低都会对结果造成影响（2）红细胞与4单位抗原从右往左加入（3）吸取红细胞与病毒液，充分混匀边搅边加（4）4单位抗原现用现配，此时病毒凝集力强，且较易混匀（5）在静置过程中，不能振动反应板，在静置过程中轻拿轻放，注意在温箱中放置的温度和时间。（6）拿出反应板时，立即看结果(7)稀释血清时，移液器不能离开液面，防止产生气泡，导致移液体积不准确