基因重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具基因工程的产物一、基因工程的概念是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组技术和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的生物类型和生物产品，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术；也叫基因拼接技术。最早创立基因工程技术的科学家是：美国科学家科恩DNA重组技术的基本工具工欲善其事,必先利其器.想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?•基因工程培育抗虫棉的简要过程：•实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性二、DNA重组技术的基本工具二、DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”--“分子缝合针”--“分子运输车”--限制性核酸内切酶DNA连接酶载体1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（1）来源：主要是原核生物；（2）种类：（3）特点：（4）结果：约4000种；识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（切点）断开。(6个,4、5、8个)形成两种末端黏性末端平末端1.这类酶在原核生物中起什么作用?2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？T1234512345AEcoRI只能识别GAATTC的核苷酸序列只从G和A之间切开;SmaI只识别CCCGGG的核苷酸序列,只从C和G之间切开,画出切割后的结果.几种限制酶识别序列的比较限制酶所识别的序列有什么特点以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称重复排列尝试写出这几种识别序列被切开所形成的末端，并观察他们的特点•什么叫黏性末端？当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。1、种类：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶2、DNA连接酶——“分子缝合针”类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键2、作用部位：双链DNA片段之间磷酸二酯键DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个双链DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？3、载体——“分子运输车”作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？(2).作为运载体必须具备的条件1.能够在受体细胞中自我复制并稳定地保存。2.具有限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。4.必需是安全的，不会对受体细胞有害。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素抗性基因。质粒的存在与否对受体细胞生存没有决定性作用，但复制只能在受体细胞内完成。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒是基因工程最常用的载体。注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中；能在宿主细胞中自我复制并稳定存在；具一个或多个限制酶切位点；具标记基因；对受体细胞无害质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由是()A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选质粒是基因工程最常见的载体，它的主要特点是()①能自主复制②不能自主复制③结构很小④是蛋白质⑤是环状RNA⑥是环状DNA⑦能“友好”地“借居”A、①③⑤⑦B、②④⑥C．①③⑥⑦D．②③⑥⑦在受体细胞中能检测出目的基因是因为()A、目的基因上有标记B、质粒具有某些标记基因C、重组质粒能够复制D．以上都不正确关于质粒的叙述正确的是()A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子B、质粒是唯一的载体C、重组质粒是目的基因D、质粒可在宿主外单独复制下列黏性未端属于同一限制酶切割而成的是()A、①②B、①③C、①④D、②③下图为DNA分子的切割和连接过程。(1)EcoRI是一种酶，其识别序列是，切割位点是与之间的键。切割结果产生的DNA片段末端形式为。(2)不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶的作用是在与之间形成键。而起“缝合”作用的，能连接平末端的连接酶是。答案：1.限制酶GAATTC鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌吟脱氧核苷酸磷酸二酯键黏性末端2.DNA或T4DNA连接酶鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌吟脱氧核苷酸磷酸二酯键T4DNA连接酶coliE习题:已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一++++预期二++——预期三+—+—预期四+———既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链连接部位相同点双链单链在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键二者都由蛋白质构成•为什么要有“目的基因的获取”这一步？•为什么要有“目的基因的获取”这一步？