聚合酶链反应及基因突变检测方法

聚合酶链反应及基因突变检测方法上海交通大学医学院刘湘帆讲师聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增对标本的纯度要求低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C~95C退火（annealing）:40C~70C延伸（extension）:72C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。PCR原理5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物添加反应混合液及样本变性退火加入试管中延伸5’3’5’3’继续延伸5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaq循环PCR原理5’3’3’3’3’5’3’3’5’3’3’第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’第n个循环2n个拷贝PCR原理94C(30s)40-60C(30s)72C(30-60s/kb)MeltAnnealExtendThePolymeraseChainReaction(PCR)1820-30X94C(30s)40-60C(30s)72C(30-60s/kb)MeltAnnealExtendCycle#2NIH20-30X二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。1模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等模板DNA需较高的浓度RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng2、引物（Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则设计引物的原则：二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18~25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）引物浓度：0.1~0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20~200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性Taq酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。最适酶量：1-2.5U（酶量过多，导致非特异性扩增）TaqDNA聚合酶复制的保真性：TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。耐热的DNA多聚酶：PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2~10倍。5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响虽然Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。6、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH=7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq酶的活性）（二）PCR的反应条件反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94~97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性2、时间第一次变性应给予足够时间（5~7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长指数增长期线形增长期平台期循环数#理论值实际值Log产物DNAPCR过程的实时监测平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置：试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区PCR技术的质量保证：基因扩增检验的全过程的质量保证室内质量控制和室间质量评价PCR实验系统中的污染源及防污染措施防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量（二）PCR技术的质量保证分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）分析后因素：报告形式、反馈的信息等第二节以PCR为基础的相关技术以PCR为基础的相关技术逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)定量PCR(quantitativePCR)多重PCR(multiplexPCR)免疫PCR差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR(insituPCR)一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3`末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增二、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是-肌球蛋白基因绝对定量PCR1.外参照系统的设置2.内参照系统的设置实时定量PCR对核酸扩增反应进行直接和动态的监测，实现对靶基因的实时定量分析荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量荧光信号的检测方法：1、DNA结合染料技术2、水解探针技术（TaqManprobe）技术3、杂交探针技术TaqManTM5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimersAddMasterMixandSampleDenaturationAnnealingReactionTubeTaqlRQProbeRQ5’3’TaqManTMExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaqQR5’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’TaqR5’4.Detection5’3’TaqR5’lRRQ实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用CEA基因在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，因此在肿瘤细胞内可检测到其转录本，而在正常成人体内极少表达。正常成人体内CEA基因表达胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达在肿瘤发生血道转移时，外周血中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异的技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关键。胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达三、多重PCR•在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。DMD基因外显子缺失的检测四、差异显示PCR（differentialdisplayPCR,DD-PCR）一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。差异显示RT-PCR(DifferentialdisplayRT-PCR)第三节点突变的检测技术PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等位基因特异性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide,ASO）单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）融点曲线分析（meltingcurveanalysis）PCR产物的序列分析点突变一、已知点突变的检测方法1.PCR-RFLP利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。BclIRFLP（血友病A）2.等位基因特异性寡核苷酸杂交被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为15~20bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降5~7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。3.DNA芯片技术（DNAchip）在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。s4.Southern印迹杂交二、未知点突变的检测方法1.单链构象多态性（single-strandconformationalpolymorphism，SSCP）突变DNA的PCR产物经变性后产生两条与正常DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测150~200bp长度的DNA片段。2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)