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菌种选育cerevisiae@163.com提纲一、菌种选育方法1.1概论1.2自然选育1.3诱变育种1.4杂交育种1.5基因工程1.6理性化筛选及介绍二、应用1.1、概论抗生素工业生产有三个主要环节，即菌种、发酵和提炼。这三个环节都对抗生素生产有重要影响，而其中以菌种的影响最大。菌种的优劣不但影响抗生素的产量，也直接影响抗生素产品的质量。菌种选育(selectionstrain)的目的是改良或改变菌种的特性，使其符合工业生产或科研的要求。菌种选育过程由三个环节组成：一是使菌种产生变异；二是筛选出变异的菌株；三是使变异菌株的特性得到表达。选、育菌种选育包含两方面的要求，一是选到好菌株，二是为好的菌种创造一个最适合的生长环境，从而最大限度的提高发酵单位。因此在菌种筛选中，选和育不可分割，选到好菌种以后，我们还应该为好的菌种进行培养基方面的改良，使菌种能达到最好的生产水平。比如说培养基组分的微调，运用数学方法找到培养基最佳比例。菌种选育的理论基础遗传与变异是生命的基本特征，也是菌种选育的理论基础。遗传是指子代和亲代间的连续性、相似性的现象。而子代与亲代间的不连续、差异性的现象叫变异。微生物由于细胞结构简单，细胞核内多数只有一条染色体，往往以基因突变为主。自发突变频率较低，一般为千万分之一到百万分之一。DNA和遗传密码DNA是由多核苷酸聚合形成的，组成核苷酸的碱基包括两种嘧啶碱（胸腺嘧啶T、胞嘧啶C）和两种嘌呤碱（腺嘌呤A、鸟嘌呤G）。其中AT之间通过两个氢键结合在一起。CG之间通过三个氢键结合在一起。DNA分子由四种不同碱基组成，三个碱基决定一种氨基酸，称为三联密码。DNA→mRNA→氨基酸→蛋白质生物性状过程：遗传信息→酶→反应→性状1.2自然选育抗生素产生菌在使用和保藏过程中，由于细胞内或环境因素的影响，不可避免的要发生变异。这种变异是自然发生的，是不定向的、是缓慢进行的。主要表现为产量降低、产孢子能力减退、菌落形态不纯、存活能力下降、产色素能力改变等。为了保证纯种生产、稳定生产和提高产量，菌种工作者要进行菌种复壮和自然选育工作。什么是自然选育自然选育是一种纯种选育方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有生产水平的菌株。因此，它能达到纯化、复壮菌种，稳定生产的目的，生产上将该方法称为自然分离。自然选育有时也可用来选育高产量突变株，不过这种正突变的几率很低。自然选育流程生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落，移种斜面种子(初筛斜面)摇瓶初筛高产菌株沙土管保藏斜面种子摇瓶复筛高产纯化株生产试验进一步选育或保藏1）单孢子悬浮液的制备：用无菌生理盐水或者无菌水制备单孢子悬浮液，在显微镜下计数，也可经稀释后在平板上进行活菌计数。2）分离及单菌落培养：根据计数结果，定量稀释后制成50~200万个单细胞/ml的菌悬液，取适量加到平皿培养基上，培养后长出分离的单菌落。按丝状真菌、放线菌菌落大小不同，分离量以5~20个菌落/平皿为宜。3）筛选：将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，成熟后接入发酵瓶，测定发酵单位的过程，称为筛选。可以分为初筛、复筛两个过程。初筛系指初步筛选，以多量筛选为原则。因此，某些菌株，初筛可以用不母瓶，将斜面直接接入发酵瓶，测其产量。复筛是对初筛得到的高产菌株的复试，以挑选出稳定高产菌株为原则。每一初筛通过斜面可进2~3只摇瓶，并重复3~5次，用统计分析法确定产量水平。初、复筛都要同时以生产菌株作对照。复筛选出的高单位菌株至少要比对照菌株产量提高5%以上，并经过菌落纯化、摇瓶单位波动情况，以及糖、氮代谢等的考察，合格后方可在生产罐上试验。复筛得到的高单位菌株应制成沙土管、冷冻管或液氮管进行保藏。这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基(琼脂块)用打孔器取出，培养一段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛验证。琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展、筛选实验实现了自动化和半自动化，省去了繁琐的劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。但筛选工具微型化的实验结果的准确性还有待提高。1.3诱变育种自然选育有一定的局限性。用诱变剂处理菌种，可以加速突变过程，提高突变频率，扩大突变幅度，从中筛选出具有各种优良特性的突变菌株。这一过程称为诱变育种，它广泛用于各种抗生素产生菌的育种。物理诱变和化学诱变物理诱变紫外诱变，英文简写UV微波诱变激光诱变电离辐射快中子低能离子注入紫外诱变紫外线（ＵＶ）波长在100—400nm的电磁辐射。紫外线杀菌或诱变原理：紫外线作用于DNA，使其产生胸腺嘧啶(TT)二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成微生物变异或死亡。紫外线会使空气中的分子氧变成臭氧，臭氧释放的原子氧有杀菌作用。波长在260—280nm处的紫外线杀菌力最强，因为核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。紫外诱变之光修复光修复现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活DNA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率下降。所以在诱变育种中微生物经UV照射时或照射会后应放在黑暗处或红光下进行，通常情况下诱变后冰浴2h或暗培养1小时可降低其对可见光的修复率。紫外诱变应用举例紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为200～300nm．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。操作步骤：斜面中加入无菌生理盐水或者无菌水，将孢子刮下。将孢子液放入一已灭菌的、装有玻璃珠的三角瓶内用用手或者放在摇床上震荡20-30分钟，以打散孢子。将孢子倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单孢子滤液装入试管内，一般处于浑浊态的孢子液含孢子数可达108个／ml左右，作为待处理孢子液。取5m1制备的孢子液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。取未照射的制备孢子液和照射孢子液进行稀释分离，取照射孢子液平皿培养。计数活孢子数，计算死亡率。挑取单菌落进行筛选。某些细节上的改动：在对放线菌孢子进行紫外诱变时，有时会先把孢子刮到“发芽水”中。使孢子萌发后再进行紫外诱变处理。这种“发芽水”的主要成分是淀粉、葡萄糖、硫酸铵等，作用是促使孢子萌发，增加变异率。有资料中提到将处理以后的菌液接入种子培养基使其萌发，培养6-8小时以后再分离。为增加紫外诱变的变异率，可以加入助诱变剂氯化锂或咖啡因等。如果紫外灯的波长和功率不可调节，尽量摸索合适的照射时间和距离，诱变剂量对筛选有很大的影响。微波诱变微波是一种高频率的电磁波，利用微波进行诱变具有设备简单、操作简便和安全可靠的特点。其诱变原理是能刺激水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动。在2450MHz频率作用下，水分子能在1s内180度来回震动24.5×108次。这种震动能引起摩擦，因此可以使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦，孢子内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损,使得DNA结构发生变化，从而发生遗传变异。微波诱变实例下面以某大学处理Vc伴生菌为例介绍如何使用微波诱变。取准备好的菌悬液(浓度为108/ml)10mL于无菌平皿内，调整微波炉的功率为800W，中等火力，脉冲频率为2045MHz，分别照射5s、10s、20s、30s。采用每照射5s后将平皿冷却后再进行照射，照射时间累计。吸取微波处理后的菌悬液，稀释涂布并培养，计算致死率及变异率。激光诱变一定量的激光照射生物体，其能量被生物大分子直接或间接吸收以后，可引起分子激发光解离、分解及生物大分子的自由基反应等，从而导致DNA分子或染色体发生畸变，使生物性状发生突变，这为选育和改良生物品种，提高生物品质提供了有利条件。He-Ne激光诱变法铜蒸气激光诱变育种成功案例：有报道称He-Ne激光对红霉素链霉菌孢子及原生质体的诱变效应。分离到红霉素发酵单位提高27.2％的辐照株。He-Ne激光对金霉素孢子的诱变效应。结果表明，小剂量He-Ne激光对金霉素孢子的萌发具有促进作用，大剂量He-Ne激光的照射对金霉素的孢子具有致死作用；激光诱变金霉素孢子的正变率最高达到6.6％。采用He-Ne激光对金霉素链霉菌原生质体诱变处理，再生菌株产抗能力与其本菌株相比，四环素产量平均提高9.32％，最高提高20.6％。He-Ne激光和聚乙二醇对红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合，融合子产抗能力与亲本相比，最多提高了28.04％，且具有良好的遗传稳定性。电离辐射X、α、β、γ射线，波长短，能量高，有较强的杀伤力。作用原理：可引起水和其他物质在吸收能量后的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。应用：用于杀菌或菌种诱变。γ射线是由某些放射性同位素如60Co发射出的高能辐射，具较强的穿透力，能致死所有的生物。电离辐射之Co60应用以某大学对阿维菌素生产菌进行诱变为例。单孢子悬液的制备：向生长良好的新鲜孢子斜面中加入10ml无菌水，用无菌接种环刮下孢子，倒入无菌的含有玻璃珠的250ml三角烧瓶中，振荡打碎30min，过滤得单孢子悬液，使用血球计数板计数。Co60照射诱变方法：分别吸取10ml单孢子悬液(孢子浓度1×107个/ml左右)于50ml无菌三角烧瓶中，依次照射，剂量分别为400、700、1000Gy。经过Co60γ射线处理后的单孢子悬液稀释、涂布于固体基本培养基上，于28℃培养箱中倒置培养96h。后续实验：结合5-氟尿嘧啶和蛋氨酸筛选模型进行诱变处理。获得发酵单位和有效组分B1a提高的菌株。快中子诱变快中子是一种高速的中子流，一般在裂变时产生。此方法最近几年用的比较少，大多为60-70年代所使用。安徽某药厂对林可霉素生产菌株进行的快中子诱变处理：取一支生产用新鲜斜面，加生理盐水15ml，刮下孢子，玻璃珠打碎、过滤，制成单孢子悬液，吸2ml于安瓿瓶中，然后分别用1.28×1012快中子/cm2剂量，0.5×1012快中子/cm2剂量处理，涂平皿做对照，计算死亡率、变异率，置30±0.5℃恒温，室内培养7~10天，然后分别挑取不同形态的单菌落接斜面，进行摇瓶初筛。低能离子注入离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术，其诱变育种是集物理诱变和化学诱变为一体的综合诱变方法，可使细胞中的染色体畸变、导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅提高变异的频率。其优点是在死亡率较低的情况下能大幅度提高变异率。低能离子注入应用下面是华药新药中心对生产美伐他汀的菌种进行氮离子注入诱变的实例。取长好的新鲜斜面，加无菌水制成孢子悬液，脱脂棉过滤，收集单孢子悬液，取稀释10倍的孢子悬液均匀涂布在无菌平皿中风干，于注入机靶室进行脉冲式注入，离子能量为100keV，注入剂量分别为1×1013、5×1013、1×1014、1.5×1014ions/cm2。菌株经离子注入后，涂布在含10μg/mL制霉菌素抗性平板上，共筛选到了158株菌株，考察离子注入剂量