免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析..

免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析宋砚明[e-mail]免疫组化（IHC）的应用介绍免疫荧光（IF）的应用介绍流式细胞术（FC）的应用介绍IHC、IF、FC区别与联系免疫组织化学原理及特点利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）细胞抗原一抗二抗辣根过氧化物酶（HRP）3，3-二氨联苯胺（DAB）显色剂棕褐色络合物IHC反应原理示意图组织切片/芯片制作2.组织芯片应用领域组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的基础研究、临床研究、应用研究和新药开发等。免疫组化染色（IHC）；原位杂交（ISH）；荧光原位杂交（FISH）；原位末端标记分析（TUNEL）；原位PCR以及激光捕获显微分离系统辅助的cDNA杂交。1.组织芯片组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及DAN分子，是一种高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的关系。3.Abgent现有组织切片/芯片产品全套鼠类器官组织切片；全套猴类器官组织切片；人类常见癌症组织切片；组织芯片客户定制服务。组织芯片/切片应用免疫组化流程示意图2.SP法原理：根据生物素(Biotin)与链霉亲和素(Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后，生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合；二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～特异性一抗～生物素化的二抗～HRP标记的链霉亲和素复合物。特点：该法孵育时间短（通常为10min），灵敏度高以及低背景染色等特点。1.SABC法原理：SABC法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗体～生物素化二抗～SABC复合物。最后用底物显色剂显色。特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。3.Polymer酶标二抗法原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具有很高的信号放大作用。特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进行内源性的生物素封闭。IHC二抗原理及选择4.直接酶标二抗法该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就可能检测不到。IHC常用酶标二抗原理示意图2.AEC显色法产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)是过氧化物酶(Peroxidase)的显色底物，在过氧化物酶的催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC显色原和与之配套的稀释液。试剂盒组成：AEC显色原（试剂A）AEC底物缓冲液（试剂B）1.DAB显色法产品描述：二氨基联苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)是过氧化物酶(Peroxidase)的显色底物，在过氧化物酶的催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显色。试剂盒组成：DAB显色原（20×）（试剂A）DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）3.BCIP/NBT显色法产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、westernblot、northernblot和southernblot，特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色物质。试剂盒组成：有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑IHC显色方法原理及选择4.BCIP/INT显色法产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、westernblot、northernblot和southernblot，特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐色物质。试剂盒组成：有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑免疫组织化学结果分析2.非特异性显色石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的次数与冲洗时间。组织富含内源性的生物素与过氧化物酶，建议使用相关试剂进行封闭。发生抗原异位。蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。1.显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低一抗浓度或减少孵育时间。孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时间。3.显色强度弱一抗浓度过低或孵育时间过短，建议增加一抗浓度或延长孵育时间。试剂超过保质期，建议实验前确认试剂的保质期。操作过程冲洗过度，建议适度冲洗。免疫组织化学常见问题分析4.无染色组织中无目的抗原的表达。一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前确认一抗的种属来源。显色物质与HRP系统不匹配，建议实验前确认显色体系。免疫荧光原理及特点免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术。免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。免疫荧光（Immunofluorescence,IF）免疫荧光原理示意图免疫荧光实验过程细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%）细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）细胞膜穿透（TritonX-100等）封闭（3%BSA-PBS等）一抗孵育荧光二抗孵育胞浆/核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI）封片荧光显微镜拍照免疫荧光结果分析免疫荧光双染色抗体的选择直接法：一抗种属来源无要求标记两种不同荧光素的一抗。间接法：一抗种属来源来源不同二抗分别标记不同荧光素。细胞核衬染染料：DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料它可以透过完整的细胞膜，因此以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。Hoechst33342是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在紫外激发光作用下发出兰色荧光.能够透过完整的细胞膜，可用于活细胞染色。碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。细胞浆衬染染料：鬼笔环肽（phalloidin）由鬼笔鹅膏真菌（Amanitaphalloides）产生的一种环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F肌动蛋白的重要试剂。荧光抗体的选择：绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等。红色荧光素：PE，Alex546等。各种荧光染料原理及选择2.信号弱或无信号无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达量高的细胞或组织。细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时间或浓度。一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度。二抗选择错误（种属不匹配），建议选用与一抗种属相匹配的二抗。1.背景过高一抗质量不高，建议使用特异性高、效价高的一抗。一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗浓度。封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间。洗涤不充分，建议增加冲洗次数与时间。可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景。3.荧光猝灭快荧光素本身特性决定，光稳定性差，建议选用光稳定性好的荧光素二抗。用普通的封片剂封片，建议选用防荧光猝灭剂封片。免疫荧光常见问题分析4.细胞有自发荧光使用了戊二醛固定，建议在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光。材料本身（如石蜡）有自发荧光，建议设立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色。细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细胞中死细胞／活细胞比例高；流式细胞术定义及原理流式细胞仪（FLOWCYTOMETOR）：进行流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）:利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。流式细胞术（FlowCytometry,FC）细胞抗原一抗二抗荧光物质（FITC,PE等）不同颜色的激发光FC反应原理示意图激光源转化为计算机识别数据流式细胞仪工作原理图流式细胞术实验过程细胞悬浮液制备（浓度为1～5×106个/ml）细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）细胞膜穿透（冰冷的甲醇等）封闭（3%BSA-PBS等）一抗孵育荧光二抗孵育流式细胞仪分析人外周全血细胞双参数散点图直方图：单参数分析流式细胞术常见结果分析散点图：多参数分析常用细胞表型及意义：（ClusterofDifferentiation,CD）CD3总T细胞CD4T辅助/诱导细胞亚群CD8T抑制/细胞毒细胞亚群CD19B细胞抗原LL:CD3-CD4-B细胞群+细胞毒T细胞亚群LR：CD3+CD4-细胞毒T细胞亚群UR：CD3+CD4+T辅助细胞亚群UL0.70UR24.2LR22.3LL52.80荧光补偿示原理荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器出去除匹配荧光以外的任何荧光信号。当采用两种或两种以上荧光标记时（如FITC,PE），当携带两种荧光素的细胞受到激光照射激发时，将发出两种不同波长的荧光。然而，荧光染料所发出的荧光都具有一定的波长范围（宽发射谱性质），虽然各自的荧光峰值不同，但发射谱范围会有一定的重叠。因而就会造成不同通道之间的荧光干扰，对实验结果造成影响。荧光补偿示意图AnnexinV-FITC/PI凋亡检测原理在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。将AnnexinV进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的AnnexinV-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡中晚期的细胞和死细胞，碘化丙啶PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。图片引自凋亡检测结果分析荧光强度/背景过高一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗浓度。封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间。洗涤不充分，建议增加冲洗次