循环肿瘤细胞(CTC)检测在肺癌中的应用

循环肿瘤细胞（CTC）检测在肺癌中的应用肿瘤疾病近期疗效的判断方法临床因子作为预后与预测因子•预后：T,N,Mstaging,PSscore•预测：–吸烟状况：指导靶向治疗–性别：指导靶向治疗–种族：指导靶向治疗–组织学：指导化疗和靶向治疗影像学方法非侵入地、直观地对患者的肿瘤大小变化情况进行评估。缺点：•存在一定的健康危害或健康隐患•肿瘤大小常与肿瘤的恶性程度或浸润能力不完全一致•费用昂贵•滞后性•灵敏性低病理学方法手术或活检获得病灶组织/周围淋巴结组织，进行病理学染色和分析，是目前唯一明确肿瘤有否转移的金标准缺点：•精确度不够高•是侵入性检查手段•易造成扩散•人工误差大•难以标准化血清肿瘤标记物测定血清肿瘤标志物的浓度往往可以在一定程度上提示肿瘤的发展程度缺点：•特异性不高•易受非特异蛋白的干扰•其他的病理生理状态影响导致假阳/阴性结果1869年AustMedJ，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外(CTC)血管内增殖(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞扩增血管生成上皮－间质转化（EMT）间质－上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官CTC检测预测PFS及OS指示预后效果复发转移预测与分期有助于肿瘤个体化治疗的药物筛选和治疗方案的确定是传统的影像学及其他生物标志物的补充检测手段有助于寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物肿瘤细胞作为生物标志物•外周血和肺静脉血中的循环肿瘤细胞（CTCs）–临床意义:•转移的辅助标志物？•可以预测治疗？•预后因子？•最小损伤的突变检测?获取CTC需要解决的技术问题从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。三种技术过滤法•ISET:IsolationbySizeofEpithelialTumorcells•8μm孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞•敏感性低梯度密度法•肿瘤细胞和单核细胞密度小于1.077g/ml•CTC纯度低，混入较多白细胞•肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉•聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)对细胞有毒性免疫磁珠法•肿瘤细胞表面抗原•CTC纯度低，混入较多白细胞•不能有效排除细胞碎片•假阳性和假阴性高CellSearch---免疫磁珠+流式细胞分析+化学发光90年代中期开始摸索捕获、分析CTC的方法1999-2003大量临床实验建立CellSearch与CTC的临床相关数据2004获得美国FDA批准用于临床2009ClevelandClinic十大医学突破第一名2009PrixGalienUSA最佳医学技术奖2010.1中国CTC在复发转移乳腺癌上的应用注册实验2011.5CTC在小细胞肺癌上的应用实验研究……%ProbabilityofSurvivalTimefromBaseline(Months)02468101214161822242628300%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%20Logrankp0.000121.9Months10.9Months5CTCsn=87(49%)5CTCsn=90(51%)CellSearch是全球第一也是唯一经FDA批准可用于临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品1983磁流体JClinOncol.2011Apr20;29(12):1556-63.Epub2011Mar21.Evaluationandprognosticsignificanceofcirculatingtumorcellsinpatientswithnon-small-celllungcancer.1肺癌是最常见的原发性恶性肿瘤，85%的肺癌患者为非小细胞肺癌，大多数患者发现时已是晚期，其5年生存率只有2%。2目前，仍然缺乏有效的生物标记物预测治疗的有效性。CTC是一个潜在的疗效预测因子。3验证能否在NSCLC患者中检测出CTC及CTC能否预测治疗有效性。背景实验流程病人入组基线CTC检测化疗一个疗程CTC检测统计分析患者入组标准未做过化疗，且4周内未做过放疗病理学确诊为非小细胞肺癌IIIA,IIIB,IV期准备进行标准的细胞毒疗法5年内未患过恶性肿瘤实验方法CellSave专用收集管采集血液采集血后于室温储存并于96小时内进行检测Cellsearch系统进行检测患者化疗前CTC数量（基线CTC）与临床特征的关系IV期患者CTC数量明显多于IIIB期患者，IIIB期患者的CTC数量又明显多于IIIA期患者。肝转移及骨转移患者中CTC数量明显多于其它转移患者。患者化疗前CTC数量与肿瘤转移地点的关系所有非小细胞肺癌病人所有Ⅳ期非小细胞肺癌病人基线CTC数量与无进展生存期和总生存期的关系基线CTC数量少于5的患者无进展生存期和总生存期明显高于基线CTC数量大于等于5的患者。化疗前后CTC数量与患者无进展生存期和总生存期的关系化疗后CTC数量少于5的患者无进展生存期和总生存期明显高于CTC数量大于5的患者。化疗前后CTC数量都少于5的患者无进展生存期和总生存期明显高于只有一次测出CTC数量少于5的患者。化疗前后CTC的数量变化反映临床疗效化疗前化疗后化疗后CTC数量减少患者的临床疗效好于CTC数量增加的患者结论CTC能在IV期非小细胞肺癌患者中检出CTC数量的变化反映了临床疗效CTC数量与OS和PFS相关，是非小细胞肺癌的一个新的预后判断因子CTC在判断是否存在转移中有重要参考价值对于原发性肺癌患者，CTC计数在有远处转移的肺癌患者中有显著升高，相关性优于CEA。CTC升高对于判断远处转移的敏感性达71%，特异性达83%CTC计数和血清CEA水平在不同切点的诊断价值治疗前和治疗后CTC的数量变化反映疗效大多数患者的CTC数量在第一个化疗疗程后（22天）下降，提示疗效好。TheAnnalsofThoracicSurgeryVolume87,Issue6,June2009,Pages1669-1675CirculatingTumorCellsinPulmonaryVenousBloodofPrimaryLungCancerPatients鳞癌中periCTC和pvCTC的数量明显高于腺癌NEnglJMed2008;359:366-77.DetectionofMutationsinEGFRinCirculatingLung-CancerCells1吉非替尼是较好地治疗非小细胞肺癌的靶向药物，但是EGFR的基因型决定了药物的治疗效果。2目前，检测EGFR的基因型需要选取患者的肿瘤组织，找到一种非侵入性的方法检测EGFR迫在眉睫。3验证能否在CTC中检测EGFR的基因型，且与药物疗效相关。背景CTC中EGFR突变与肿瘤组织中EGFR突变的一致性（SARMS方法）CTC中EGFR基因型有17个与肿瘤组织中的一样，准确率为94%，CTC数量与病情进展的关系吉非替尼治疗后CTC数量下降，伴随着疾病进展CTC数量也随之上升。肿瘤大的患者CTC数量比肿瘤小的患者多。CTC数量影像学肿瘤变化检测CTC中EGFR的基因型与组织中检测结果高度符合可以通过CTC来检测非小细胞肺癌患者肿瘤的基因型CTC数量与疾病进展密切相关结论小细胞肺癌患者活检组织及相对应的CTC中的CD56活检组织中的CD56和CTC中的CD56表达具有一致性肺癌组织肺癌肝转移组织BaselinebloodCAC肿瘤细胞a,monosomy6p11-q12;b,amplificationEGFR,c-MYC;EGFR(red)5.p15.3(green),6p11-q12(aqua),c-MYC(yellow).c,trisomyCEP3andmonosomyCEP17;d,polysomyCEP3,CEP7,CEP17and9p21.3.CEP3(red),CEP7(green),CEP17(aqua),9p21.3(yellow).外周循环肿瘤细胞的异常情况与手术切除的肿瘤细胞具有高度一致性。BaselinebloodCTC肿瘤细胞CTC中的染色体异常分子标记物与疾病的复发和生存密切相关CTC计数CTC的分子特性指示预后辅助检测抗癌药物的反应——作为预测和/或药物动力学生物标志物联合已知的分期因素，获取更精确的预后判断病人是否需要辅助化疗检测癌症复发辅助诊断实时活检——肿瘤的生物学行为阐明预后和预计的分子学特征检测抗药情况——基于获得连续样本的便利性提高对生物过程机制的了解发现并鉴定新治疗靶点CTC的应用：从细胞计数到分子特性FISH分析CTC生物学特性(A)白细胞有两份CEP7（绿色），EGFR（红色）和MET(蓝色)(B)CTC中，EGFR（红色）和MET(蓝色)基因扩增微列阵实时定量RT-PCR对CTC进行基因表达分析BIOTECAN宝藤——J&J强生国内首个CELLSEARCH商业实验室CH商业实验室CTC检测样本准备：•使用CellSave储存管采集静脉血液标本10ml•轻轻颠倒8次，防止凝块•样本室温条件(15-30摄氏度)下96小时之内接受处理•接受阿霉素治疗的患者给药之后，至少需要等待7天样本溶血及结块不能用于CTC检测！样本处理流程：7.5ml血液采集于CellSave储存管，加入6.5ml缓冲液离心CellTracks®AutoPrep®系统自动处理流程系统自动将被捕获的、经过染色的细胞置入MagNest装置的样本盒中系统自动分析后得到结果并由操作人员进行最终判读分析结果并出具报告单•若患者血液样本中CTC细胞≤cutoff值，我们将附上CTC细胞图；•若患者血液样本中CTC细胞≥cutoff值，我们只截取其中五个CTC细胞图作为代表。每周二、周五开始检测，报告将于检测后3个工作日内发送。请注意采血时注意样本保质期（96h），选择合适的采血时间。