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1微生物实验室规则与安全微生物学实验室规则医学微生物学实验的对象大多为病原微生物，具有传染性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则：1．进入实验室应穿白大衣，离室时脱下，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。2．实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声谈笑或随便走动。3．各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须放入消毒缸内，禁止随意放于桌上及冲入水槽。4．须送温箱培养的物品，应做好标记后送到指定地点。5．实验过程中发生差错或意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立即报告老师进行正确的处理。如有传染性的材料污染桌面、地面等，应立即用0.2%~0.5%“84”消毒液浸泡污染部位，作用5～10min后方可抹去。如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡5～10min后，再以自来水反复冲洗干净。6．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。7实验完毕，应物归原处并将桌面整理清洁，实验室打扫干净。最后以0.2%~0.5%“84”消毒液浸泡手5min，洗净后方可离开实验室。实验一器皿包扎及消毒与灭菌一、实验目的1、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培养皿的包扎方法。2、了解干热灭菌、紫外线灭菌、微孔滤膜过滤除菌和高压蒸汽灭菌的原理和应用范围。3、掌握高压蒸汽灭菌的操作技术。二、实验原理（1）实验室中使用的玻璃器皿简介2微生物学实验所用的玻璃器皿，大多要进行消毒、灭菌和（将“和”改为“才能”）用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的质量一般要求硬质玻璃，才能承受高温和短暂灼烧而不致破坏；玻璃器皿的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器皿的形状和包装方法的要求，以能防止污染杂菌为准；洗涤玻璃器皿的方法不当也会影响实验的结果。目前微生物学实验室中，有些玻璃器皿（如培养皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的实验室用具。（2）灭菌的常用方法和基本原理实验室常用的灭菌方法有干热灭菌法、紫外线照射法、微孔滤膜过滤除菌法和高压蒸汽灭菌法等。A.干热灭菌是用电热干燥箱（图1）加热，利用高温使微生物细胞内的酶、蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。B.紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。C.微孔过滤除菌（图2、图3）是通过机械作用滤去液体或气体中细菌、真菌孢子等的方法。D.高压蒸汽灭菌也是使蛋白质变性而灭菌，高压蒸汽灭菌锅（图4、图5、图6）灭菌时是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。3图1电热干燥箱的外观和结构图24图3图4高压蒸汽灭菌锅5图5卧式灭菌锅图6手提式灭菌锅1.安全阀；2.压力表；3.放气阀；4.软管；5.紧固螺栓；6.灭菌桶；7.筛架；8.水干热灭菌与高压蒸汽灭菌的灭菌效果与所灭物品的蛋白质含水量有很大的关系（表1）。就效果而言，湿热灭菌效果要比干热灭菌效果好（表2）。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要（表3），因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。表1蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574-801880-906145表2干热、湿热穿透力及灭菌效果比较温度/℃时间/h透过布层的温度/℃灭菌10层20层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.33101101101完全表3灭菌锅内留有不同分量空气时压力与温度的关系6压力数全部空气排出时的温度2/3空气排出时的温度1/2空气排出时的温度1/3空气完全排除时的温度空气完全排除时的温度MPaKg/cm21b/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.101.0515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121压力数全部空气排出时的温度(℃)2/3空气排出时的温度(℃)l/2空气排出时的温度(℃)1/3空气排出时的温度(℃)空气全不排出时的温度(℃)MPakg/cm21b/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.6100109115121126130941051121181241289010010911512112672901001091151217三、实验材料1、各种玻璃器皿、试管刷、洗涤剂、培养皿、移液管、牛皮纸或报纸等。2、棉花、纱布、线绳、三角瓶和试管等。3、高压蒸汽灭菌锅。四、实验步骤延伸阅读1、紫外线灭菌法紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为200—300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2），O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3-5％的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面，凳子可用2-3％的来苏尔擦洗，然后再开紫外线灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。2、化学试剂灭菌大多数化学药剂在低浓度下起抑菌作用，高浓度下起杀菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等。化学灭菌剂必须有挥发性，以便清除灭菌后材料上残余的药物。化学灭菌常用的试剂有表面消毒剂、抗代谢药物（磺胺类等）、抗生素、生物药物素。抗生素是一类有（由）微生物或其他生物生命活动过程中的（删除）合成的次生代谢产物或人工衍生物，他（它）们在很低浓度时就能抑制或感染它种生物（包括病原菌，病毒，癌细胞等）的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。气体灭菌法，利用环氧乙烷或甲醛性杀微生物的一种方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等，用于设施、设备或粉末状的医药品等，使用气体灭菌时，其被灭菌的物品以未变质为前提条件；药液灭菌法，是用药液杀灭微生物的方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等物品的灭菌，还可用于手指、无菌箱或无菌设备等的消毒，药液灭菌用于未变质的物品。通常使用的有酒精（70-75%乙醇）、0.1—1%（w/v）盐化苯类溶液、甲酚、苯酚水或福尔马林水等。81.棉塞制作2.移液管和培养皿的包扎93.高压蒸汽灭菌锅的操作（1）加水：将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水使水面与三角搁架相平为宜。（2）装料：放回内层锅，并装入待灭菌物品。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。（4）排气：通电加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。（5）升压至0.1Mpa。（6）保压：当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。（7）降压：灭菌所需的时间到后，关闭电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。（8）无菌检查：将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、注意事项1．切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2．压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。六、实验结果1、主要的灭菌技术有哪几种？2、灭菌锅的使用（步骤）3、玻璃器皿包扎（培养皿、移液管）10操作：每人尝试使用手提式灭菌锅1次，每组制作试管塞4个、三角瓶塞3个（2小，1大），练习包扎移液管4根，包扎玻璃培养皿1组灭菌。七、思考题1、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较的实验方案。2、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕之后，为什么待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？3、你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通玻璃？实验二培养基的制备一、实验目的1、学习掌握培养基的配制原理；2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养物质，需要适宜的pH值、一定的缓冲能力及合适的渗透压。在培养皿内培养微生物时需要添加凝固剂，实验室常用凝固剂是琼脂，即从石花菜等海藻中提取的多糖，是应用最广泛的凝固剂，它在96-100℃融化，46℃以下凝固，培养基经灭菌后方可使用。（1）培养基据组成成分可分为:①合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。②半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。③天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。（2）据用途可分为：①基础培养基：能满足各种微生物的营养需求的培养基。②选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离。③鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。如常用的麦康凯培养基，它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）（3）从培养基的物理状态可分为：①液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。②固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基11延伸阅读牛肉膏蛋白胨培养基的一种应用最广泛和最普通的细菌基本培养基，有时又称普通培养基，其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。（1）牛肉膏蛋白胨培养基适用于培养一般细菌，其配制方法是：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂20g水1000mlpH7.4～7.6（2）高氏1号培养基（适用于培养放线菌）可溶性淀粉2gKNO30.1gK2HPO40.05gMgSO4·7H2O0.05gNaCl0.05gFeSO4·7H2O0.001g（可用母液法）琼脂2g水100mLpH7.4～7.6（3）孟加拉红培养基（适用于培养分离真菌）蛋白胨5g葡萄糖10g磷酸二氢钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g琼脂20g1/3000孟加拉红溶液100mL蒸馏水1000mL氯霉素0.1g或农副产品培养基。③半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。12三、实验材料：1、溶液和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/LHCl、1mol/LNaOH等。2、仪器和其他用品：天平、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、药匙、pH试纸、棉花塞、报纸、棉绳、标签、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、电炉等。四、实验步