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发酵产物的提取与精制方法金维102车间2011年8月第一节萃取萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质的得到纯化或浓缩的方法根据参与溶质分配的两相不同分类：液固萃取、溶媒萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取一、溶媒萃取法1、溶媒萃取的基本原理利用该物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使之从一种溶剂转入另一种溶剂，从而使杂质去除萃取效率是以分配定律为基础的Nernst分配定律（1891）：在一定温度下，当某一溶质在两种互不相溶的溶剂中分配达到平衡时，则该溶质在两相中的浓度之比为一常数，称为分配系数。对萃取操作来讲：萃取相和萃余相中溶质的浓度之比就是分配系数；用K表示。在达到平衡时，设溶质在萃取相中浓度为CA；在萃余相中为CB。则：BACCKBACCK2、常用溶媒萃取的工艺（1）单级提炼法混合器溶剂发酵液分离器提取液残余液（2）多次提炼法混合器溶剂发酵液分离器提取液混合器溶剂分离器提取液混合器分离器提取液残余液溶剂残余液残余液（3）、多级对流萃取第一混合器分离器第二混合器分离器第三混合器分离器最后提取液提取液残余液残余液最后残余液提取液溶剂发酵液一级二级三级A90%A70%A50%3、影响溶媒萃取的主要因素(1)乳化与去乳剂乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系乳浊液的形式：水包油、油包水常用的去乳化的方法：过滤和离心、加热、稀释法、加电解质、吸附法、顶替法、转型法常用去乳剂：阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶）阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）（2）pH值红霉素在pH9.8时，在乙酸戊酯与水相间的分配系数等于44.7，而在pH5.5时，红霉素在水相与乙酸戊酯间的分配系数等于14.4。（3）温度（4）盐析（5）带溶剂带溶剂是指这样一种物质，能和被萃取物质形成复合物而易溶于溶媒中，形成的复合物在一定条件下又容易分解例如：链霉素在中性下能与二异辛基磷酸酯结合，从而在水相萃取到三氯乙烷中，然后在酸性下再萃取到水相二、双水相萃取1、发展历史始于20世纪60年代,从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离国内自20世纪80年代起也开展了双水相萃取技术研究。2、双水相的形成将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。3、常用的双水相体系高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dextran)和PEG/Dextran高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸盐或磷酸盐体系。4、双水相相平衡关系5、影响物质分配平衡的因素（1）聚合物及其分子量的影响不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，在PEG/DEX系统中，蛋白质的分配系数随着DEX相对分子量的增加而增加。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。（2）pH值的影响改变两相的电位差如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。pH值的变化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。（3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束,存在一穿过相界面的电势差(Donnan电势),它是影响荷电大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒子迁移也有相似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。（4）温度的影响分配系数对温度的变化不敏感成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4℃)低,有助于相的分离并节省了能源开支。5、双水相萃取技术的特点(1)系统含水量多达75%～90%,两相界面张力极低(10-7～10–4N·m-1),有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递(2)分相时间短(特别是聚合物/盐系统),自然分相时间一般只有5～15min。(3)双水相分配技术易于连续化操作。(4)目标产物的分配系数一般大于3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。(5)大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2个分离步骤,使整个分离过程更经济。(6)设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。6、双水相萃取的工艺流程双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循环。7、双水相的应用举例分离和提纯各种蛋白质(酶）用PEG/-(NH4)2SO4双水相体系,经一次萃取从α-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍,蛋白酶在水相中的收率高于60%。提取抗生素和分离生物粒子采用PEG/Na2HPO4体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH=8.0～8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小试收率达69.2%,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53.4%双水相和其他方法的集成A、与温度诱导相分离的集成B、磁场增强双水相C、超声波加强的双水相D、亲和沉淀的集成三、反胶团（胶束）萃取1、定义反胶束或称逆胶束(Reversedmicelle)是指当有机溶剂中加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会在有机溶剂中形成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”。2、影响反胶团萃取的因素（1）溶液的pHpH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质（2）溶液的离子强度影响微胶团的静电状态凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。（3）表面活性剂的浓度和种类（4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）3、应用举例纯化和分离蛋白质如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11.1和6.8）,用二烷基磷酸盐/异辛烷反胶束溶液萃取,并用缓冲液将混合液的pH值调至9.0,则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留在水相.四、超临界流体萃取超临界流体是处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的高密度流体。在临界温度以上压力不高时与气体性质相近，压力较高时则与液体性质更接近，由此形成的超临界流体的性质介于汽液两相之间，并易于随压力调节的特点。1、超临界流体（SCF）的特性物质状态密度（g/cm3）粘度(g/cm/s)扩散系数(cm2/s)气态(0.6-2)×10-3(1-3)×10-40.1-0.4液态0.6-1.6(0.2-3)×10-2(0.2-2)×10-5SCF0.2-0.9(1-9)×10-4(2-7)×10-4由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。2、超临界流体萃取原理超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出特定成分，以达到某种分离的目的。一般说来，物质的溶解能力与其密度成正比关系。所以，在临界点附近，温度和压力的微小变化往往会导致溶质的溶解度发生几个数量级的变化。利用超临界流体的这个性质进行分离操作效果奇佳，而且过程无相变，能耗较低。因此，超临界流体已突破了一般流体的范畴。常见的超临界流体CO2、氨、乙烯、乙烷、丙烷、丙烯、乙醇、丁醇、水等由于CO2的临界温度、临界压力较易达到，而且化学性质稳定，无毒、无臭、无色、无腐蚀性，容易得到较纯产品，因此是最常用的超临界流体。3、某些常用流体的物理特征4、超临界流体萃取设备SFE的基本流程是：由钢瓶提供高纯液体（CO2）经高压泵系统，流入保持在一定温度（高于Tc）下的萃取池。在萃取池中可溶于SCF的溶质扩散分配溶解在SCF中，并随SCF一起流出萃取池，经阻尼器减压获升温后进入收集器，多余的SCF排空或循环使用。5、超临界流体萃取的典型流程及应用1.超临界流体萃取的典型流程(1)等温法(2)等压法13P124T1=T2P1P21—萃取槽；2—膨胀阀；3—分离槽；4—压缩机T1T2P2溶质13P124T1T2P1=P21—萃取槽；2—加热器；3—分离槽；4—泵；5—冷却器P2T2T15溶质(3)吸附法13P124T1=T2P1=P21—萃取槽；2—吸附剂；3—分离槽；4—泵；P2T2T1超临界萃取的三种典型流程6、应用举例作业：什么叫双水相萃取，影响双水相萃取的因素有哪些什么是反胶团，影响反胶团萃取的因素有哪些超临界流体萃取的原理是什么