微生物常规实验操作与菌种保藏

微生物常规实验操作与菌种保藏2011年5月16日1、实验器皿的准备试管、培养皿、三角瓶等玻璃器皿的准备•新的玻璃器皿，一般先用浓度为5%~6%的盐酸浸泡6hs以上，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3遍。旧的玻璃器皿，只需洗干净，同样用蒸馏水冲洗2~3遍即可。•洗干净的玻璃器皿倒置晾干或烘干后备用。•包装、灭菌。•干热灭菌原理：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度（160-170℃）一般165℃，时间2小时。注：干热灭菌温度不能超过180℃，否则包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。•湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）一般培养基用121℃，灭菌30min。灭菌结束后先断电源，等压力降为零后再开盖。一般在压力降为零，温度降至约60℃时开盖。灭菌：干热灭菌、湿热灭菌2、培养基的制备制备过程：称量，配制，调pH，分装，灭菌。•建议所有药品分别用水溶解后再混合，若药品种类较多则建议前一种药品充分溶解后再加另一种药品，且要边加边用玻璃棒搅匀，待药品完全溶解后，补充水分至所需体积。•如果配制固体培养基，需等药品充分溶解好以后，再加入琼脂，并充分搅拌，防止糊底，最后补足所需水分。•如果配方中含有淀粉，需先将淀粉用少量冷水调成糊状，然后再在火上加热搅拌并补充水分，待完全溶解后使用。•调节pH：培养基溶解均匀后，冷却至室温时用pH试纸测定pH值，然后根据要求加酸或碱（一般用1mol的HCl或NaOH）,要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调pH。•培养基的分装：将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热分装。•分装时要避免培养基沾染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为以下几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4~1/5。（2）液体、半固体培养基装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积的1/2。3、斜面摆放•斜面摆放时，斜面不超过试管长度的1/2。培养基充满试管底部约1cm，然后再形成斜面。4、平板的制备•一般每皿需培养基约15~20mL。手持培养皿在酒精灯火焰附近打开皿盖，倒入培养基，当培养基覆盖培养皿2/3面积时停止倾倒培养基，盖上皿盖，平放在桌面上。5、接种与培养接种方式：斜面接种、液体接种、平板接种。1、斜面接种左手持菌种管和斜面管，使斜面向上。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，并用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入试管内、冷却、挑菌，立即转入斜面底部，沿斜面划线。2、液体接种•由斜面菌种接种到液体培养基中的方法。•操作与固体接种方法基本固体接种相似，只是在将接种环送入液体培养基中时，使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，轻轻摇匀，即可培养。或者先在长好菌种的斜面试管中加入无菌水，然后用接种环将菌体轻轻洗下，混合均匀后直接倒入液体培养基中。•如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。3、平板接种•将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：•划线法：见平板划线操作。•点种法：一般用于观察丝状真菌，点接于平板表面即可。6、微生物菌种保藏•斜面保藏•液体石蜡保藏•甘油保藏•冷冻干燥保藏•液氮保藏•斜面保藏此方法的优点时简便、可行，使用方便，缺点是保藏时间不长，每隔一段时间需重新移植培养。传代多了，菌种易变异。•液体石蜡保藏液体石蜡需间隙灭菌2~3次，最后于105℃烘干水分。保藏时，液体石蜡液面高出斜面最顶端1cm以上。•甘油保藏，一般甘油的最终浓度为40%，置于-20℃保存。•冷冻干燥保藏，先使微生物在极低温度下（-70℃左右）快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。一般用脱脂牛奶作为保护剂，浓度为10%~12%，8磅（112℃，不超过113℃）灭菌20分钟。•液氮保藏，一般用10%的甘油或二甲基亚砜作为保护剂。此外，程序降温过程与步骤十分重要。7、微生物的分离、纯化涂布操作时，用力要均匀，以防划破培养基。要涂布到菌（土壤）悬液全部渗入培养基方能结束。•厌氧微生物的分离和培养Hungate滚管法：Hungate和Bryant等人在分离家畜瘤胃中微生物和沼气微生物时均采用此法。8、注意事项•酒精灯的使用酒精灯添加酒精时，必须先将火焰熄灭。酒精装量不超过总容积的2/3。•实验过程中切勿使酒精等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，在用湿布掩盖灭火，必要时用灭火器。微生物实验操作,首要的是要保证安全，包括实验室安全、人身安全等。•化培养基时，不要从上面握三角瓶的瓶口，要从侧面捏住三角瓶的瓶口，并且不要从上方观察培养基融化情况，以防培养基喷出伤人。•每种培养基不是可以培养所有的微生物的，每种菌种都有适宜的培养基。•当我们拿到一个菌种后，一定要将其接种到最适培养基上进行活化。活化好后，用其中的1~2支进行扩繁，再进行下一步试验操作。其它活化好的菌种一定要妥善保藏。无菌操作环境的控制•微生物无菌操作对环境要求严格，最好设有专门的实验室或无菌操作室。要求环境清洁，人员流动少。•超净工作台的使用：细菌、酵母菌与小型丝状真菌要分开在不同的超净台上操作，建议每类菌固定在某个超净台上操作。使用前后开紫外灭菌30分钟左右，并且用之前后都要用75%的酒精擦拭一遍。•实验操作后要及时将培养物移出无菌操作台，不要将无菌操作台作为临时培养箱。同时无菌操作垃圾要及时清除，千万不要堵塞操作台的过滤器。9、小结•微生物学常规试验操作与菌种保藏是一项实践动手能力很强的工作。•是一项非常细仔且要求责任心很强的工作，安全第一。同时,又是其它研究工作的基础。