微生物平板划线试验

平板划线实验实习一、相关基础理论－－细菌的培养一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖，以便进一步观察和研究他们的各种生物学特征。为了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除采用适宜的培养基，并考虑到其他的培养条件之外，掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重要环节。1、培养基在土壤、水、食品、空气以及人和动、植物中，不同种类的细菌混杂地生活在一起。若要研究其中某种细菌，就必须将各种细菌进行分离，以得到只含有这一种细菌的纯培养。当细菌分离成纯种后，常需要接种到有关的培养基中，以测试其各种生物学性状，不同的细菌需要不同的培养基进行培养。1、培养基培养基按其物理性状，分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。培养基按用途，分基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基。按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%琼脂含量一般为0.2%-0.7%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究按用途不同划分基础培养基鉴别培养基用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化牛膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基加富培养基2、常见培养基基础培养基肉浸液培养基：一般细菌都能在此培养基内生长营养琼脂培养基：一般细菌培养使用蛋白胨水培养基：靛基质实验2、常见培养基加富培养基血琼脂培养基：可作为肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、嗜血杆菌等的分离培养，还可用于某些菌落的溶血作用巧克力琼脂培养基：淋球菌及脑膜炎双球菌在此培养基上生长较佳2、常见培养基选择培养基亚硒酸盐增菌液：作为沙门氏菌属及某些志贺氏菌属增菌用伊红－美蓝琼脂：分离沙门氏及志贺氏菌属细菌Baird-Parker培养基：用于金黄色葡萄球菌的培养分离2、常见培养基鉴别培养基三糖铁琼脂：供鉴定肠道细菌用双糖含铁琼脂：供鉴定肠道细菌用葡萄糖枸橼酸盐琼脂：共作鉴别大肠杆菌与产气杆菌之用二、细菌的接种方法将混合的细菌分离的方法有多种，平板划线法即是其中之一，该方法主要是借划线而将混杂的细菌在琼脂平板表面分散开，是单个细菌能固定在某一点，生长繁殖后形成单个的菌落以达到分离纯种的目的。当细菌分离成纯种后，一般还可用斜面、液体和半固体培养基来检验细菌的培养特征，因此接种方法可相应的分为四种。表3常见的几种细菌的培养和基接种方法举例平板划线接种法斜面培养基接种法液体培养基接种法穿刺接种法菌种葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液大肠杆菌培养物大肠杆菌培养物枯草杆菌培养物变形杆菌培养物痢疾杆菌培养物培养基普通琼脂平板琼脂斜面培养基普通肉汤培养基半固体琼脂培养基1、斜面培养基接种法常用于细菌的大量繁殖，保存菌种，或观察其某些生化特性。琼脂斜面、尿素培养基、双糖铁培养基、柠檬酸盐培养基等具有斜面外形的固体培养基均可用此法接种。1、斜面培养基接种法步骤：（1）用记号笔在待接种的培养管上写明标记。（2）点燃酒精灯。（3）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管，使菌种管位于左侧，斜面部均应向上。（4）以右手拇指和食指捏持转动两管试管塞，以便在接种是易于拔取。（5）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌。1、斜面培养基接种法（6）以右手手掌及小指，小指及无名指分别拔取并夹持两管试管塞，将两管管管口灭菌。（7）将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管。再伸进待接种的培养基管，进行斜面培养基接种，从斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养基表面。1、斜面培养基接种法（8）接种完毕，灭菌两试管的管口，塞好试管塞，并放至原来的位置上。重新烧灼接种环，灭菌后放回试管架上。接种好的试管放37℃温箱培养，18～24小时候观察生长情况。1、斜面培养基接种法图2-1斜面培养基接种法2、液体培养基接种方法可用于观察细菌不同的生长状况，有的呈均匀混浊，有的呈沉淀生长，还有的在液体表面形成菌膜；另外还可以供测定细菌生化特性用。凡是肉汤、葡萄糖蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均用此法接种。2、液体培养基接种方法步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。（2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及接种的肉汤管。（3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨，蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中。塞好试管塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。（4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长情况。2、液体培养基接种方法图2-2液体培养基接种法3、穿刺接种法常用于半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、双糖铁培养基等的接种，前者用于测定细菌的动力，后二者则用于观察细菌的生化反应。3、穿刺接种法步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。（2）如斜面培养基接种法，握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。（3）右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，刺达近管底部，但不必及于管底，然后循原路退出。（4）接种完毕，接种针重新灭菌后放至试管架上，塞好试管塞，37℃培养18～24小时后取出观察细菌的生长情况。3、穿刺接种法图2-3穿刺接种法4、平板划线接种法常用于分离单个菌落，也可用于观察细菌的生长状况和观察某些生化反应。沙门氏菌的各属在亚硫酸铋琼脂平板上呈黑色，具有金属光泽；志贺氏菌属在HE琼脂平板、SS琼脂平板、麦康凯琼脂平板上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。4、平板划线接种法——接种方法（1）标记在培养皿底面，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、日期等。4、平板划线接种法（2）灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环，并放置火焰中烧灼灭菌，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2~3次。然后将接种环移开火焰，待其冷却。4、平板划线接种法图2-4灭菌接种环4、平板划线接种法（3）取菌种左手持装有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞，将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来的位置。4、平板划线接种法（4）分离划线接种细菌（四区接种法）①左手持琼脂平板培养基（将皿盖反放在桌上酒精灯附近），尽量使之直立以免空气中的细菌落入其中，并靠近火焰。右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄膜（约占平板的1/10），视为一区。划线时使接种环与接种平板面呈30~40度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。②旋转琼脂平板90度，烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表面以使其冷却。灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5），此视为二区。4、平板划线接种法③旋转琼脂平板90度，灼烧接种环灭菌并使之冷却。将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板1/4），此为三区。④旋转琼脂平板90度，接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此视为四区。各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。4、平板划线接种法图2-5四区划线4、平板划线接种法4、平板划线接种法（5）划线完毕，将琼脂平板放进皿盖，将培养皿倒放，送进37℃温箱培养。（6）培养18~24h后将培养皿取出。观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。三、金黄色葡萄球菌和普通大肠杆菌平板划线接种实验1、实验内容2、实验目的3、实验用品4、实验步骤5、观察结果1、实验内容（1）四区划线法接种金黄色葡萄球菌至血琼脂培养基平皿一个（2）四区划线法接种普通大肠杆菌至伊红美蓝培养基平皿一个2、实验目的（1）熟悉四区划线法接种细菌（2）培养严格的无菌操作意识3、实验用品（1）菌液：金黄色葡萄球菌和普通大肠杆菌菌液各一管。（2）实验器械：酒精灯一个、血平板一个、伊红美蓝平板一个、接种环一支。4、实验步骤参照前面介绍的四区划线法的操作步骤操作，一定要在无菌条件下，养成无菌意识。（1）标记（2）灭菌接种环（3）取菌种（4）分离划线接种细菌（5）划线完毕，送进37℃温箱培养（6）培养18~24h，观察结果5、观察结果结果观察在18~24小时以后菌落：标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落。5、观察结果(1)菌落的形态特征：大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。5、观察结果(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3种情况。①α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；②β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。5、观察结果(3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。(4)气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。圆形、突起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽，不透明菌落，直径1～2mm