5 RNA合成

分子生物学教研室文建雷基因表达分子生物学教研室文建雷基因表达(geneexpression)是基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。分子生物学教研室文建雷转录(transcription)是以DNA的一条链为模板(template)合成出一条与模板DNA链互补的RNA分子的过程。转录产生初级转录物为RNA前体（RNAprecursor，原初转录物，primarytranscript），它们必须经过加工才能成为有生物活性的RNA。分子生物学教研室文建雷翻译(translation)是依照mRNA的序列合成蛋白质的过程。DNA的遗传信息通过mRNA表达为蛋白质中氨基酸顺序。分子生物学教研室文建雷5RNA生物合成5.1RNA合成概述5.2原核生物RNA合成5.3真核生物RNA合成与加工5.4RNA的自我剪切与催化5.5RNA的复制分子生物学教研室文建雷RNA为线性单链分子，极少有环状RNA分子。RNA分子中可形成短双螺旋部分，称为发夹。分子生物学教研室文建雷一个细胞中含有许多不同的RNA子，长度50nts到数万nts。tRNA：transferRNA分子生物学教研室文建雷rRNA：ribosomalRNA16SrRNA分子生物学教研室文建雷mRNA:messengerRNA，编码一个或多个蛋白质，将DNA的信息传递给蛋白质。寿命为几分钟。分子生物学教研室文建雷5.1概述RNA的转录合成类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向。分子生物学教研室文建雷5.1.1RNA合成的途径RNA的合成方式有DNA转录和RNA复制。DNA转录：以DNA的一股为模板合成一条互补RNA的过程，转录后的RNA序列中的U与DNA的T配对。RNA复制：以RNA为模板合成RNA。分子生物学教研室文建雷5.1.2RNA合成的方式——不对称转录转录区只有一小段DNA的一条链作为模板链(templatestrand)进行转录，称为不对称转录。分子生物学教研室文建雷DNA分子中仅有一条链作为RNA的模板。如果DNA的两条链均作为RNA的模板，则每个基因必将产生两条有互补顺序的RNA。遗传学证明每个基因只控制一个蛋白质，故实际上只合成了一条RNA链，或者即使合成两条RNA链，其中也只有一条有功能。分子生物学教研室文建雷1963年JuliusMarmur和PaulDoty利用DNA-RNA杂交技术，以侵染枯草杆菌(Bacillussubtilis)的噬菌体SP8为材料进行实验，证明DNA只有一条链被转录。SP8的DNA两条链碱基组成很不平均，其中一条链富含嘌呤，另一条富含嘧啶，富含嘌呤的为“重”链，富含嘧啶的为“轻”链。可用密度梯度离心分离两条链。分子生物学教研室文建雷用SP8感染枯草杆菌细胞后提取RNA，再与变性的噬菌体DNA链杂交，结果RNA只与重链形成DNA-RNA的杂合分子，因此DNA双链中只有一条链作为转录的模板。分子生物学教研室文建雷Marmur和Doty很幸运地选用SP8做实验，因为它的全部基因都是同一条DNA链中转录而来。而另一些噬菌体，包括T4和λ噬菌体，部分基因由一条链转录而其他基因则由另一条链转录；因此若用这些噬菌体而不是SP8做实验，则不能成功地说明问题。分子生物学教研室文建雷如果用RNA聚合酶在体外对DNA双螺旋进行转录，则结果取决于DNA模板受到损伤的程度。如将T7DNA变性，使RNA聚合酶能与单链DNA结合，则两条均能被转录。但如果用天然的完整双链DNA为模板，则RNA聚合酶仅能和启动子结合，从而只能转录在活体内被转录的那条链。分子生物学教研室文建雷模板链又称为负链(minusstrand，－)、反意义链(anti-sensestrand)，它与转录出来的RNA反义(序列相反)。分子生物学教研室文建雷模板链是针对某一基因而言的。不做为模板的DNA链为编码链，又称为正链(plusstrand,+)、有意义链(sensestrand)，它与转录出来的RNA同义(序列相同)。编码链的序列与转录的RNA序列相同，只是在编码链上的T在RNA中为U。分子生物学教研室文建雷5.1.3转录方向、起始及终止位点转录是从DNA分子的特定部位开始的，这个部位也是RNA聚合酶全酶结合的部位。转录时不需引物，由RNA聚合酶催化以NTP为底物，连续合成RNA链。分子生物学教研室文建雷[-32P]GTP和非标记的GTP可证明RNA的合成方向，若RNA中的32P无变化，证明合成方向为5’→3’，反之则是3’→5’。用代谢抑制剂3’-脱氧腺苷（cordycepin）证明RNA链合成方向为5’→3’。分子生物学教研室文建雷在DNA上开始转录的第一个碱基规定为+1，与转录相反的方向称上游(upstream)；转录方向为下游(downstream)。在上游方向与转录起点相邻的位置定为-1。分子生物学教研室文建雷分子生物学教研室文建雷DNA上都有终止转录的特殊信号——终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。分子生物学教研室文建雷DNA链上从启动子直到终止子为止的序列称为一个转录单位。一个转录单位包括一个或几个基因。分子生物学教研室文建雷5.2原核生物RNA合成5.2.1RNA聚合酶5.2.2启动子5.2.3转录过程5.2.4转录后的加工5.2.5σ因子的替换分子生物学教研室文建雷5.2.1原核生物RNA聚合酶①RNA聚合酶的特性E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶（RNAPolymerase，RNAP）分子。它催化RNA主链中核苷酸间的3’,5’-磷酸二酯键的形成，在37℃时RNA链的延伸速度可达40nt/s（翻译速率15密码子/s，复制速率800bp/S）。RNA的合成必须有DNA模板存在，并且要非常精确。转录作用并没有校正（proofreading）机制。分子生物学教研室文建雷②原核生物RNA聚合酶的组成原核生物的RNAP是由ββ’α2等亚基和2个Mg2+构成的全酶(Holoenzyme)。呈椭圆球形结构，全酶可结合约60bp的DNA序列。分子生物学教研室文建雷phosphocellulosechromatographySDS-PAGE磷酸纤维素层析分离后得到3个峰，进行SDS-PAGE电泳泳道1全酶，2-4为分离得到的3个峰，5纯化的分子生物学教研室文建雷原核生物中，、、’亚基的大小比较恒定；亚基变动较大，分子量32kD~90kD，对转录不同的基因RNAP选择不同的亚基。分子生物学教研室文建雷③原核生物RNA聚合酶各亚基的功能β和β’共同组成了酶的催化中心。它们的序列与真核生物RNA聚合酶的最大亚基相关。β亚基可能是酶和核苷酸底物结合的部位。利福平(rifampicin)并不影响聚合酶与DNA模板的结合，但它占据了新形成的DNA-RNA杂交链的通道，因此阻止RNA链（2～3个寡核苷酸）的延伸，使聚合酶停留在启动子处。分子生物学教研室文建雷β亚基的基因rpoB的突变可使细菌对利福平有抗性。分子生物学教研室文建雷纯化聚合酶的各个亚基’分子生物学教研室文建雷对利福平抗性和敏感菌株聚合酶亚基的重组证明利福平作用于β亚基分子生物学教研室文建雷β’亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。肝素是一种多价阴子，能与β’亚基结合。因此，肝素能与DNA竞争与RNA聚合酶相结合，从而在体外抑制转录作用。可见β’亚基有较强的碱性，可与模板DNA相结合。分子生物学教研室文建雷α亚基的功能可能是识别其相应的启动子。当T4噬菌体感染E.coli时，其α亚基的精氨酸残基上被ADP-核糖化，修饰作用使RNA聚合酶核心酶对因子的亲和力降低，而对T4编码的Mot亲和力增加，因此只识别T4的启动子。辨认调节因子、两个结构域分别与启动子（C-Terminaldomain与启动子的上游元件，对于无上游元件的启动子没有作用）结合以及与聚合酶的其他部份结合。分子生物学教研室文建雷分子生物学教研室文建雷因子的作用原核生物因子的功能：帮助核心酶辨认启动子；解开DNA的双螺旋。分子生物学教研室文建雷大肠杆菌有不同的因子分别转录不同类型的基因，这在基因表达调控中有重要作用。70转录大部分基因；32转录热休克蛋白基因；28转录与运动相关基因；s转录与抵抗外来压力相关基因；54转录与氮利用相关基因等。分子生物学教研室文建雷分子生物学教研室文建雷全酶上亚基结合脱离后，ββ’α2称为核心酶。核心酶也可催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。分子生物学教研室文建雷④原核生物RNAP基因E.coliRNAP各亚基的基因存在于几个不同的操纵子中。编码亚基的rpoA位于遗传图的74.1min处；编码亚基的rpoB位于遗传图的90.1min处；编码’亚基的rpoC位于遗传图的90.2min处；编码70亚基的rpoD位于遗传图的69.2min处。分子生物学教研室文建雷分子生物学教研室文建雷细菌的RNAP远比某些噬菌体特有的RNAP结构大且复杂，仅由一条肽链组成的噬菌体RNAP只能识别噬菌体DNA所有的少数几个启动子，而不能识别其他启动子。例如噬菌体T3和T7的RNAP分子很相似，都是一条多肽链，MW约11kD。它们在37℃时合成RNA速率可达200nts/s。分子生物学教研室文建雷宿主细胞RNAP能转录细胞内的任意一个转录单位。这些转录单位中有一些可由RNAP直接转录，不需要其他因子的帮助。但大多数转录单位需要更多的蛋白质因子存在下才能被RNAP所转录。所以宿主细胞具有大而复杂的RNAP在与许多其他因子相互作用中起主要作用，而不是其催化活性的要求。分子生物学教研室文建雷RNAP在体内和体外都是经过4步反应聚集而成。酶的三个亚基（α、β、β’）都参与了和σ亚基的结合。2α→α2α2+β→α2βα2β+β’→α2ββ’（核心酶）α2ββ’+σ→α2ββ’σ（全酶）分子生物学教研室文建雷5.2.2启动子（Promoter）转录时RNAP在DNA分子上与启动子识别和结合。启动子是由一些短的保守序列组成的。启动子是DNA上可与RNAP特异结合并起始转录的部位（序列），位于转录起点附近。启动子可位于上游，也可在下游（个别）。分子生物学教研室文建雷5.2.2.1启动子的分离用足迹法可鉴定并分离出启动子（或其它蛋白），启动子处的核苷酸顺序具有特异性可结合RNAP。Footprinting:atechniquederivedfromprinciplesusedinDNAsequencing,isusedtoidentifythespecificDNAsequencesthatareboundbyaparticularprotein.分子生物学教研室文建雷当DNA被RNAP结合时，其覆盖部分不被DNase水解，因此会被部分消化。适当条件下每个DNA分子中未与蛋白质结合部分的每个磷酸二酯键都被切割一次，切割位置可通过DNA一条链的末端标记来识别。分子生物学教研室文建雷对末端标记分子在敏感位点进行部分剪切会产生一个特殊长度的片段。通过凝胶电泳根据长度不同进行分离，具有标记末端的片段产生一条标记条带，条带的位置与该片段的碱基数相一致。最短的片段移动最快。分子生物学教研室文建雷对于游离DNA每个敏感键都会被破坏，产生一系列条带，每个条带的位置代表一种碱基，因此，根据游离DNA的对照实验可以知道RNAP在启动子上结合的位置和序列。分子生物学教研室文建雷通过足迹法修饰技术(DMSfootprinting)可找到RNAP与启动子的接触位点分子生物学教研室文建雷用修饰特定碱基的试剂处理RNAP与DNA的复合体，并将其与游离DNA以及未被修饰的复合物相比较。可以显示被聚合酶保护的位点不被修饰，而有些位点更易修饰，说明这些位点DNA更加暴露。如果先修饰DNA再将其与RNAP结合，这样就可以确定与聚合酶结合的位点。分子生物学教研室文建雷结果显示启动子的－35区和－10区包含了与聚合酶接触的大多数位点。这些位点经修饰后可阻止与聚合