细胞凋亡及其调控分子机制

细胞凋亡及其调控分子机制1.凋亡的概念，与坏死的区别2.凋亡信号通路3.细胞凋亡相关蛋白、细胞凋亡与疾病4.细胞凋亡检测细胞凋亡名称的由来英国Aberdeen大学病理系Kerr教授1972年我和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式，联想到秋日落叶，我们就把它称作ApoptosisSydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstituteBerkeley,CA,USAb.1927(inUnionofSouthAfrica)H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)Cambridge,MA,USAb.1947JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstituteCambridge,UnitedKingdomb.1942THE2002NOBELPRIZEWINNER王晓东：从事的是细胞凋亡规律的研究。2000年，他和助手们进行了一项实验，研究一种神秘的线粒体蛋白质Smac，这种蛋白质可以打破肿瘤的“坚硬堡垒”，诱使肿瘤细胞“自杀”，对研究治疗癌症方法有重要帮助。从1996年他建立起自己的研究室后，他的论文成果在8年间被其他科学家引用超过了15000次。第一节细胞凋亡的特征及意义一、细胞凋亡的基本特征程序性细胞死亡programmedcelldeath,PCD在发育过程中定时出现的生理性刺激诱导的细胞死亡。用于选择性地清除多细胞动物体内一些无用的或危险的细胞。依据形态学不同，程序性细胞死亡可划分为凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、肿胀性死亡3种形式。细胞凋亡：apoptosis在生理和病理条件下，由基因控制的自主有序的死亡过程。生理条件下，凋亡用以清除单个细胞，继而由巨噬细胞内吞，最后再由溶酶体执行降解功能。自噬autophagy:是一种在进化上保守的真核细胞内转运泡的运输机制，它可将细胞本身的亚细胞成分如蛋白、胞质或细胞器，通过溶酶体中的水解酶进行消化降解和循环。凋亡和自噬都是细胞内重要的生理过程。坏死Necrosis：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。诱发因素特定的生理病理因素，药物缺氧、药物、毒素组织分布单个细胞分布成片细胞组织反应形成凋亡小体，被周围组织细胞内容物溶解细胞吞噬，无炎症反应释放，有炎症反应坏死凋亡形态学：细胞体积皱缩变圆，细胞浆失水浓缩肿胀，外形不规则化细胞膜保持完整，形成泡状，凋亡破裂后期内陷包裹核物质和细胞器形成凋亡小体细胞核核膜完整，核皱缩，染色质固缩核肿胀破裂，聚集在核膜下，最后核裂成碎片染色质不规则外移细胞器大多数保持完整，线粒体肿胀，多受损，溶通透性增加，释放细胞色素酶体破裂，线粒体肿胀破裂凋亡坏死DNA阶梯状片段化随机断裂磷脂凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻外翻ATP合成并提供能量耗竭凋亡坏死生物化学：出现180-200bp大小及其倍数的核苷酸片段，DNALADDER细胞坏死与凋亡的形态区别细胞凋亡的诱发因素生理性因素损伤刺激肿瘤坏死因子家族病毒感染FasL、TNFP53、PTEN转化生长因子细胞毒素细胞癌基因自由基神经递质治疗因素谷氨酸、多巴胺化疗药物去除细胞生长因子紫外线基质失去粘附特性中草药细胞凋亡的生理意义1、确保正常发育、生长，根据代谢需要调节细胞数量、保持成体器官正常体积。如：指（趾）间隙的形成2、维持内环境稳定如：清除受损、突变或衰老的细胞3、防御功能如：使受到病毒感染的细胞凋亡第二节细胞凋亡的发生机制一、凋亡相关基因（一）ced基因线虫（c.elegans），1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中产生凋亡，发现14个基因与凋亡有关；且虫体透明，易于观察。细胞内与凋亡有关的基因分2类：1．存活基因：ced-9：bcl-2蛋白家族2．致死基因：ced-4：凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1,apoptosisproteaseactivatingfactor-1,3.致死基因：ced-3：Caspase家族(cycteinylaspartate-specificprotease).天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶线虫人类Caspase：1996年Alnemri等统一命名的一类与ICE/Ced-3同源性半胱氨酸蛋白酶。（二）caspase与细胞凋亡1.特点：(1)是一种Cys蛋白酶(2)底物Asp-X(3)以酶原形式存在(4)活化的Caspase特异性水解一套底物，导致不可逆的细胞凋亡(5)细胞内有Caspase抑制剂。IAP,inhibitorsofapoptosisproteins2.结构特征①以无活性的形式存在。②在Pro-Caspases的N端均含有一段的前区域（Prodomain）。③活性形式均是由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体。一分子Pro-Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基。④大亚基的C端含有活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故属于半胱氨酸蛋白酶类。3.分类：14种（1）细胞因子前体：caspase1，4，5，11，12，13，14不是凋亡的直接效应分子。（2）凋亡起始分子：caspase2，8，9，10（3）凋亡效应分子：caspase3，6，7参与介导细胞凋亡。ICE家族成员A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程执行者启动者4.caspase活化：Caspase酶原有很低的活性若caspase过表达，酶原在高浓度下可自身活化Caspase8，9含有死亡效应域（deatheffectdomain,DED），可相互作用，使酶原自身活化。Caspase8：激活所有酶原,如:Caspase3,6,7,9Caspase9：活化需线粒体释放CytC,活化后激活Caspase2,3,6,8,10。Caspase3,6,7:效应Caspase。5.Caspase作用：（1）灭活细胞凋亡抑制蛋白:鼠:Caspase活化的DNA酶:Caspaseactivateddeoxyribonuclease,CAD，细胞凋亡抑制物：inhibitorofCAD,ICADICAD与CAD结合，CAD无活性，Caspase剪切ICAD，ICAD失活，CAD活化，CAD游离，进入细胞核内降解DNA。人：Helacell，DFF（DNAfragmentfactor)，与ICAD同源Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶：多聚·ADP-核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase,PARP）抑制Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶,与基因完整性的监护有关。PARP降解，Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶活性增加，裂解核小体间的DNA，导致细胞凋亡。Caspase（2）降解细胞结构蛋白：降解核纤层蛋白，肌动蛋白，核分裂相关蛋白(3)切割细胞效应蛋白。(4)降解其他的caspases6.Caspase活化抑制剂IAP,inhibitorsofapoptosisproteins细胞内存在的Caspase抑制蛋白，IAPinhibitorsofapoptosisproteins家族，阻止细胞凋亡过程。二、细胞凋亡的诱导发生细胞凋亡的信号传递（1）Fas介导细胞凋亡（2）细胞色素C介导的细胞凋亡（3）粒酶GrB诱导细胞凋亡12DR：死亡受体deathreceptors,DR含DD：死亡结构域，deathdomain,DD（DD存在于DR之胞内区，和FADD蛋白中）FADD蛋白：Fas相关的死亡结构域，Fas-associateddeathdomain（FADD蛋白含有DD，DED；可与pro-caspase8结合）DED：死亡效应结构域，deatheffecterdomain,DED（存在于FADD蛋白、一些起始caspase酶原如pro-caspase8中）（1）死亡受体介导的细胞凋亡（外源性的）FasFas//FasLFasLFas-----细胞表面受体，跨膜蛋白；共4个蛋白1.FasLigand（FasL）是Fas的天然配体，两者介导细胞凋亡，FasL主要在淋巴细胞膜上表达。2.FasFas/Apo-1存在于细胞表面的特定区域，一旦被FasL或Fas抗体激活，可将信号传递到细胞内。Fas属肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受体（NGFR）超家族，是细胞凋亡的受体信号，又叫死亡分子。Fas/Apo-1(CD95)Fas从人KT3细胞株分离的cDNA克隆。Apo-1从人SKW6.4细胞株分离的cDNA克隆。后来证明两者完全一致，命名为Fas/Apo-1，或称CD95。Fas蛋白位于10q33，编码335AA，成熟319AA，是跨膜蛋白。由胞外区，跨膜区、胞内区组成。胞内区有80AA,称死亡结构域（deathdomain,DD）3.FADD蛋白:Fas相关死亡结构域蛋白：Fas-associateddeathdomainprotein包括：DD，死亡结构域deathdomainDED，死亡效应结构域deatheffectdomainDeathinducingsignalcomples,DISCFasL与Fas结合(同三聚体)Fas的DD成簇，与FADD蛋白结合，FADD蛋白活化Caspase8活化Caspase3，6，7活化细胞凋亡（1）Fas介导细胞凋亡死亡诱导信号复合物Deathinducingsignalcomplex,DISC诱导因素→跨膜电位↓（ΔΨm↓）PTP开放（通透性转换孔）凋亡启动因子（细胞色素C，smac，AIF）释出AIF：凋亡诱导因子（2）线粒体相关的细胞凋亡途径（内源性的）现在，提得最多的、比较公认的线粒体在凋亡中的作用有两点：（1）细胞色素C的释放；（2）Smac/Diablo的释放。（2）细胞色素C介导的细胞凋亡CytC释放入胞质与胞浆接头蛋白Apaf-1结合Apaf-1寡聚化，募集Caspase9原Caspase9活化Caspase2,3,6,8,10活化细胞凋亡凋亡蛋白酶激活因子1，Apoptoticproteaseactivatingfactor-1Caspaserecuitmentdomain5Fas介导细胞凋亡Caspase8活化凋亡诱导因子凋亡蛋白酶激活因子EndoG:endonucleaseG核酸内切酶GAIF：ApoptosisinducingfactorsApaf-1:Apoptoticproteaseactivatingfactor-1线粒体仍有足够的CytC，及其他细胞色素，呼吸链完整，产生ATP，保证Caspase活化，细胞凋亡。CytC释放过多，呼吸链破坏，氧消耗，但是不产生ATP，导致细胞坏死。细胞含有caspase抑制剂，不能导致caspase依赖的细胞凋亡；当线粒体巨通道破坏，CytC释放：AKtJNKp53Bcl-2（3）粒酶的基本结构和功能定义：粒酶，Granzyme，Gr，是CTL和NK细胞杀伤性颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称，以酶原形式存在。分类：GrA,GrB,GrH,GrM,类胰蛋白酶2功能：酶切靶细胞的多种底物蛋白，启动细胞凋亡。GrB活性最高，与其他粒酶，穿孔素（PEN,Perforin）一起储存在CTL的杀伤颗粒中。粒酶进入靶细胞：CTL识别靶细胞，杀伤性颗粒移向靶细胞一极（极化）GrB,PEN等蛋白释放入细胞间隙穿孔素(PEN)协助GrB进入靶细胞，定位在胞浆和胞核CTL肿瘤细胞CTL正在诱导肿瘤细胞凋亡GrB诱导细胞凋亡（1）Caspase依赖途径：GrB切割Caspase10Caspase3,7,PARP(多聚ADP核糖聚合酶)，Bid，DNA片段化因子(DFF)细胞凋亡GrB确保靶细胞即使缺失1种或几种Caspase成员时，仍能走向凋亡。切割DFF，使CAD游离，降解DNA结构蛋白