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实验三间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）郑一诫复旦大学上海医学院免疫学系2010－12－1上海医学院免疫学系P2间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）上海医学院免疫学系抗核抗体（ANA）ANA是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分（脱氧核糖核蛋白DNP、DNA、可提取的核抗原ENA、RNA等）为靶抗原的自身抗体的总称。主要是IgG、也有IgM、IgA。并无器官和种族的特异性。B上海医学院免疫学系P3间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）上海医学院免疫学系实验原理：生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。B上海医学院免疫学系P4间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）上海医学院免疫学系实验原理：B上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤：上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤一：准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或ExtranMA01（默克公司），再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤二：样品准备1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤三：加样在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。加样体积:25µl/反应区(5x5mm)12345样品1样品2样品3阳性对照阴性对照上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤四：孵育将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温温育30分钟。上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤五：加样用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。冲洗1秒钟小杯内浸洗5分钟上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤六：加样将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。加样体积:20µl/反应区(5x5mm)上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤七：孵育从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤八：加样用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150µl)伊文氏蓝进行复染。冲洗1秒钟小杯内浸洗5分钟上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤九：封片在盖玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。封片体积:10µl/反应区(5x5mm)上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B实验步骤十：结果判断荧光显微镜下观察荧光。上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：荧光显微镜下观察1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：核仁型：核仁部分呈现荧光上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：胞浆型上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：着丝点型上海医学院免疫学系间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B结果判读：混合型：存在两种以上的类型上海医学院免疫学系ANA结果判断1：100阴性阴性，标本中未检测到抗核抗体1：100阳性微量对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病1：320阳性阳性提示某种风湿病或其他疾病滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）B上海医学院免疫学系P24间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）上海医学院免疫学系实验原理：生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。B上海医学院免疫学系上海医学院免疫学系上海医学院免疫学系P27间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）上海医学院免疫学系BThankYou!