血红蛋白电泳的意义和判断(高级版)

2目的血红蛋白结构和功能的回顾SebiaCAPILLARYS2/Minicap血红蛋白检测说明血红蛋白临床结果说明3血红蛋白的结构血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.Normalhemoglobins,containalpha,beta,delta,andgammaglobinchains.三维结构4亚单位2alpha链○2alphagenes3«非»alpha链:beta,delta,gamma○1bgene,1dgene,2ggenesChromosomes16Chromosomes11HbAbHbFgHbA2ddbdbAgAgGgGgChromosomes16Chromosomes11HbAbHbFgHbA2dHbAbHbFgHbA2ddbdbAgAgGgGgChromosomes16Chromosomes11HbAbHbFgHbA2dHbAbHbFgHbA2ddbdbAgAgGgGgChromosomes16Chromosomes11HbAbHbFgHbA2dHbAbHbFgHbA2ddbdbAgAgGgGg正常结果HbA:bHbF:gHbA2:d+-琼脂糖凝胶Hydrasys®(Sebia)碱性缓冲液成人新生儿01020304050607080901000122436%Age(months)HbF血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES)?血红蛋白疾病血红蛋白性质变化:血红蛋白分子病○结构异常,一个或数个氨基酸变异或缺失,都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变○常见血红蛋白变异体b-globin:S–C–DPunjab–E…血红蛋白含量变化:地中海贫血○合成或合成调控异常:bglobinbThalassemiasglobinThalassemias合并型:血红蛋白分子病Hemoglobinopathies/地贫Thalassemias血红蛋白遗传病遗传性疾病基因学图谱正常基因异常基因异常血红蛋白类型目前,已经证实的有超过1000种以上的变异体(,b,gandd)大部分变异体出现频率较低,并且没有明显临床症状4种主要变异体(HbS,HbC,HbEandHbDPunjab)出现频率较高(特定人群)○携带者会出现健康问题○儿童可能在出生时即伴随有严重症状血红蛋白疾病的区域分布图Thalassemias常见与地中海区域:意大利,西班牙,希腊,近东地区,非洲北部.同样常见于东南亚:泰国,印度,越南,中国,印尼.o临床症状*Beta地贫重症型-严重贫血(需要长期输血治疗)*Beta地贫中间型*Beta地贫轻微型-无临床症状Beta地中海贫血o常见区域bo没有Beta链合成b+合成能力下降Alpha地中海贫血o临床症状:根据Alpha基因的表达状态,有4个不同程度的Alpha地贫症状*1个基因表达沉默:静止型(非常难检测到,在出生会测到HbBart’s1-2%)*2个基因表达沉默:轻型alpha地贫,在出生会测到Bart’s2-10%*3个基因表达沉默:血红蛋白HbH病,出生时出现2-30%Bart’s,儿童-成人出现10-15%HbH*4个基因表达沉默:HbBart’s胎儿水肿综合征(死胎)o常见区域常见与远东地区,非洲和地中海区国家异常靶细胞小红细胞贫血HbFHbA2HbH其他特征一条链缺失000正常正常0出生时少量的(~2%)HbBart’s2条链缺失000正常正常或减少0出身时HbBart’s(~5%)3条链缺失++轻微的到严重的也许增加减少10-15%不稳定血红蛋白溶血性贫血(HbH)4条链缺失--严重的100%HbBart’s00胎儿水肿综合症(hydropsfetalis)基因型诊断血常规临床症状检测结果/无HbA:NHbA2:N(2-3.5%)-/-Thalassaemia2杂合体(静止型)轻微小红细胞症MCV:75-80fLMCH:20-24无HbAandHbA2:NHbBart’s0-3%atbirthConfirmationbymolecularbiology-/--Thalassaemia2纯合体小红细胞症血红蛋白减少Hb:11-12g/dL无明显临床症状HbAandHbA2:NHbBart’s2-8%atbirth--/-Thalassaemia1杂合体MCV:65-75MCH:20-24需要分析序列分析或DNA序列分析--/-HbH小红细胞症血红蛋白减少Hb:8-11g/dLMCV:55-65MCH:20-24出现溶血脾脏肿大HbA2NorHbBart’s5%HbH10-20%--/---Thalassaemia1纯合体(死胎)严重贫血水肿胎Hb:8-11g/dLMCV100-110MCH无法存活死胎AbsenceofHbAandHbFHbBart’s80-100%HbPortland5%镰刀型红细胞血症变异体出现在6GAG(谷氨酸)GTG(缬氨酸)NSSASabnormalgenenormalgeneNHbSNNHbSASNHbAHbSNNSSHbAHbSChromosomes16HomozygoteChromosomes11HétérozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes16HomozygoteChromosomes11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgC型血红蛋白分子病变异体位置:AA6:GAG(谷氨酸)AAG(Lys)HbAHeterozygoteACHbAHbCNHbASCCompoundheterozygotyHbAHbCNHbSHétérozygotecompositeACSCChromosomes16HomozygoteChromosomes11HétérozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes16SCheterozygotecompoundChromosomes11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgD型血红蛋白分子病常见区域:常见于印度.特点:变异体位置b121Glu(谷氨酸,负电荷)→Gln(谷氨酰胺,不带电荷)(D-LosAngeles=D-Punjab)(6differentHbDaccordingtothepositionofthemutation)碱性缓冲液中:电荷下降→M电泳速度变度变慢,靠近HbS临床症状:基因杂合体:无症状(仅在电泳中发现D区带)HbAfraction:65–70%HbDfraction:30–35%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbDfraction:100%E型血红蛋白分子病常见区域:常见与东南亚地区.特点:变异位点b26Glu(谷氨酸,负电荷)→Lys(赖氨酸,正电荷)碱性缓冲液:总体带电荷下降→凝胶电泳中,出现在HbC附近临床症状:杂合体:无症状HbAfraction:65–70%HbEfraction:30–35%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbEfraction:100%下列情况下,需要进行血红蛋白检测临床和遗传问题(产前诊断)贫血,小红细胞症新生儿筛查对来自地贫高发区人口,进行筛查…对诊断有帮助的其他信息患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景(输血记录)血液全套检测,网状细胞级别和进行细胞形态镜检Hb电泳(EDTA抗凝管)离子平衡和溶血情况血红蛋白检测的几种方法目前,血红蛋白检测步骤如下:-电泳法对Hb进行检测或者使用等电聚焦电泳法-使用HPLC法进行确认.20凝胶电泳结果识别表21在pH梯度的凝胶片上,根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离Hb电泳位置取决于缓冲液PH值蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动AtpI=pH,Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating电泳分离效果好,但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断等电聚焦电泳法介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法:-通过毛细管电泳法,即可以获得与IEF方法一样的分辨率,同时检测结果量值HbA2/HbF同样精确.-出现异常变异体后:使用下列方法确认:*ITANOtest(solubilitytest)*HPLC液相色谱*Genotyping基因筛查Capillarys2Minicap全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测Capillarys2/Minicap毛细管电泳法原理Peltier温控桥Anode+Cathode-检测器氘光灯电泳高电压此时,电渗力(EOF)远远强于电场力.因此,蛋白被动从正极向负极端移动.正电极+EOF负电极-Electromigration蛋白电泳DETECTIONINJECTION带正电荷的缓冲液毛细管壁负离子鞘Capillarys/Minicap血红蛋白电泳血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程,然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来.正常质控品必须在每天检测前使用Capillarys:-检测速度:40样品/小时-试管架1至7号位放置样品,8号位放4ml溶血素Minicap:-检测速度:10样品/小时-试管架1至26号位放置样品,27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素)Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求抗凝管采血(EDTA,heparin,citrate).如果需要对输血患者采血,需要在输血前采集血液.使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000rpm,5分钟离心后样品)+4°C以上,标本最多存放7天.需要长期存放,可以洗涤红细胞后,放置于-80°C(可存放至少3个月)CapillarysMinicap血红蛋白条带识别表Capillarys/Minicap区带识别表Z15:HbHZ14://Z13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ12:HbBart’s,HbProvidence,HbJ-Mexico,HbJ-Baltimore….Z11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ10:HbHope,HbM-IwateZ9:HbA,HbCamperdown,HbPhnomPenh……Z8:AcetylatedHbF,HbAltanta,HbAthens-GAZ7:HbF,denaturatedHbS,HbPorto-Allegre……..Z6:HbD-Punjab,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbKöln,denaturatedHbE….Z5:HbS,HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.Z4:HbE,denaturatedHbC,HbKöln,HbA2variants,M-IwateHbA2variantsZ3:HbA2,HbO-ArabZ2:HbC,HbConstantSpring,SetifHbA2variantZ1:HbdA2HbA2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variant……30正常HbA2质控品条带结果可录为QC31HbAFSC质控品,可用来作为参照曲线,便于异常结果的判断32HbsA,F,A2检测结果可通过颜色进行区分异常区带显示为灰色主要异常血红蛋白变异体Z15↔HbHZ12↔HbBartZ10↔HbHopeZ9↔HbAZ7↔HbFZ6↔HbDPunjabZ5↔HbSZ