白喉疫苗工艺流程菌种

细菌性疫苗杨丽华2011年3月1.死疫苗2.活疫苗3.蛋白类疫苗4.多糖类疫苗5.多糖蛋白结合疫苗细菌性疫苗细菌性疫苗种类23白喉破伤风百日咳疫苗……451霍乱伤寒副伤寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏杆菌伤寒痢疾霍乱疫苗……脑膜炎伤寒vi肺炎流感嗜血杆菌多糖疫苗……AC脑膜炎球菌多糖结合疫苗HIB……脑膜炎伤寒vi流感嗜血杆菌多糖疫苗……百日咳疫苗伤寒疫苗结合疫苗白喉疫苗白喉疫苗一、白喉概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定外毒素对神经系统损害细菌产生的外毒素对心肌损害外毒素对肾脏损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉疫苗白喉流行特点1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌没有中间宿主，病人及带菌者是唯一的传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达高峰。二、病原学1.细菌形态白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜，不形成芽孢。白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态2.培养特性白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力⑴.白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极敏感。⑵.对消毒剂抵抗力弱，3％苯酚10min可将该菌杀死⑶.不耐热，58℃10mi或100℃1min即可被杀死。二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1.致病力自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素产生遗传学白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由β嗜菌体携带。β嗜菌体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前用于白喉类毒素生产)。四、白喉毒素1.白喉外毒素为棒状杆菌β-噬菌体tox基因表达产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55℃很快失活。3.通过物理和化学方法将其纯化。细菌毒素甲醛类毒素毒素经甲醛处理后去除毒性而保留免疫原性五、白喉类毒素甲醛浓度温度PH脱毒影响脱毒因素温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果１.温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性，一般37～38℃。２.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。３.甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。温度升高游离甲醛的浓度低毒素纯度高易发生毒性逆转提高甲醛浓度、脱毒pH、脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）防止或减轻毒性逆转类毒素的毒性逆转六、白喉疫苗工艺流程菌种（PW8株）传代扩增3～4代发酵罐培养34～35℃培养对数生长末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体收集清液超滤浓缩硫酸铵两段盐析除盐除菌氨离子及无菌检查脱毒甲醛液37℃脱毒试验（家兔）原液检定（浓度、纯度、安全等）Al(OH)3吸附成品检定（安全、效价等）七、类毒素的质量检定1絮状单位（Lf）是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。絮状单位测定毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。2纯度：≥1500Lf/mgPN3安全性试验（豚鼠）七、类毒素的质量检定4效价测定类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗体的特异性结合反应。⑴小鼠Vero细胞法将标准和待检类毒素2倍稀释3～5个稀释度，皮下免疫NIH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进行结果计算。⑵豚鼠毒素攻击法皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻击，观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分析法进行结果计算。百日咳疫苗一、百日咳概述二、病原学三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗㈠、生产工艺流程㈡、质量检定㈢、APV的效果㈣、接种不良反应急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤并发症肺炎形成肺气肿肺不张，甚至死亡。营养缺乏症百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。百日咳概述百日咳流行特点1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳病人是传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1岁以内婴幼儿发病率50%。二、病原学㈠细菌形态百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形㈡生长特性1.百日咳菌可分四种相变，Ⅰ相菌毒力最强有免疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，无免疫原性；ⅡⅢ相菌介于ⅠⅣ相之间。2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为35～36℃,最适pH6.8-7.0。3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。作用PTFHAAggsPRNACTCTHLT呼吸道粘附作用＋＋＋＋－＋－--细胞毒性＋＋－－＋＋＋＋＋免疫原性＋＋＋＋＋＋＋--1百日咳Ⅰ相菌有两大类抗原菌体O抗原表面K抗原（荚膜物质）2百日咳菌可产生外毒素(PT)内毒素其他生物活性物质，据报道有25种之多。㈡、主要抗原和生物学活性百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖↑↓重患(FHAPTPRNAgg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖↓细菌不进入组织和血液循环①干扰吞噬细胞功能AC分泌大量PT②麻痹上皮细胞功能TCT①产生血细胞增多③损伤支气管血管周HLT细胞代谢发生变化②组织胺致敏性增强围组织③分泌胰岛素增强和血糖降低.㈢、致病机理三、百日咳疫苗发展简史㈠粗制百日咳灭活疫苗第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其与致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活疫苗，工艺粗造、含量不确定。㈡全菌体百日咳疫苗(WPV)以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝集原（Agg1、Agg2、Agg3）。经过50多年的临床应用证明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题一直未解决。㈢无细胞百日咳疫苗(APV)20世纪80年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学作用的认识，产生了APV。㈣基因工程疫苗正在研究中。四、无细胞百日咳疫苗•1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取代了菌体百白破疫苗。•1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作为儿童预防免疫推荐用疫苗。•我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代中期获得正式生产文号。•近期的临床试验证明含有5种保护性抗原（PTFHAPRNAgg2Agg3）的APV效果最佳。冻干百日咳菌种（Ⅰ相CS菌株）↓接种血培养基大管培养↓36℃48-72小时培养传代接种发酵罐培养（综合培养基）↓培养≤48小时收集培养物↓第一段硫酸铵盐析及浸提↓第二段硫酸铵盐析及浸提↓透析↓密度梯度离心↓戊二醛脱毒↓透析↓超声↓无细胞百日咳原液㈠、生产工艺流程检测项目标准蛋白含量——抗原纯度测定PT和FHA不低于总蛋白质含量的85%热原测定符合规定毒性试验小鼠体重减轻试验不高于10BWDU/ml小鼠白细胞增多试验不高于0.5PLU/ml小鼠组胺致敏试验不高于0.8HSU/ml毒性逆转试验不高于0.8HSU/ml效价测定（脑腔保护力试验）不低于4.0IU/剂量㈡、质量检定•日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量控制。•美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法等与之不同。毒性试验仅要求做HST，效价测定采用ELISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。•用小鼠脑腔保护力试验（MPT）评价疫苗效果，WPV的效价明显高于APV，而且并非所有的APV均可通过MPT试验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的效价试验方法。•免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但与临床保护之间还缺乏相关性。效价测定方法探讨接种种类免疫人数病例数发病率（%）报道时间WPV56814.31983APV36411.3_584882.8APV30310.01988_423780.0APV2613.81988_271762.9APV6223.21990_373081.0表明APV的保护效果是肯定的，能够达到WPA的保护水平。㈢、APV的效果疫苗种类发热(%)持续性喊(%)红晕(%)肿胀(%)疼痛(%)APV0.8-2.84.5-9.01.4-5.51.2-5.51.4-4.8WPV6.620.59.515.420.8表明APV的不良反应明显低于WPV。㈣、接种不良反应伤寒疫苗一、概述二、病原学三、伤寒疫发展简史四、伤寒Vi疫苗1.伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学龄儿童发病率最高，两岁以下儿童和35岁以上成人发病率低。一、概述1潜伏期为7～21天病期为一个月，恢复缓慢。3表情迟钝脉搏相对缓慢，肝脾肿大和白细胞减少。2长期发热、持续高烧达10～14天、腹部不适、头痛等。2长期发热、持续高烧达10～14天、腹部不适、头痛等。典型的临床症状二、病原学1.细菌形态伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能运动。伤寒沙门氏菌革兰染色伤寒沙门氏菌电镜形态2.培养特性•在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度35-37℃，适宜的pH为7.0～7.2。•发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。1.鞭毛（H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受（1％）甲醛影响。2.菌体（O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多糖（LPS）－由多糖（重复寡糖和核心寡糖）和类脂A组成。3.莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒杆菌细胞外壁的一种荚膜抗原,Vi抗原与其致病性有关Vi来源于毒力的缩写。抗原结构血清学诊断1.肥达氏试验（widaltest）选择抗原的方法：⑴.测定O抗体用伤寒0901株（没有H和Vi抗原）用加热杀菌破坏H抗原（不耐热）⑵.测定H抗体用伤寒S株（没有O菌体抗原）用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原2.酶联免疫试验1234全菌体灭活疫苗口服Ty21a减毒活疫苗伤寒Vi多糖疫苗伤寒结合疫苗二、伤寒疫苗的发展简史1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮杀菌疫苗㈠、全菌体灭活疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用１％甲醛杀菌，0.5％石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1０亿-５亿；副伤寒甲乙由每毫升各５亿-２.5亿，细菌总量原三联疫苗为20亿-10亿。加热杀菌石碳酸防腐疫苗此法历史最久，1896年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用56℃水浴30ｍin杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标准品。丙酮杀菌疫苗1921年创制，认为对稳定Vi抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气干燥制成。1943年首次在意大