细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术

1实验二细菌培养基的配制、灭菌及接种、培养技术2第一部分细菌培养基的制备、灭菌目的要求实验材料实验程序3目的要求熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握高压蒸气灭菌技术。4实验材料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。5实验程序玻璃器皿的洗涤和包装培养基的制备无菌稀释水的制备培养基和玻璃器材等的灭菌6实验程序1（玻璃器皿的洗涤和包装）清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞的制作包装培养皿和移液管等。7实验程序2（培养基的种类）据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入15～30g/L左右的琼脂。3.半固体培养基：在液体培养基中加入3～5g/L左右的琼脂。8实验程序2（培养基的种类）常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。9实验程序2（培养基的配制方法和步骤）1.取一个300mL烧杯，装150mL蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分b.可加热促进各成分溶解c.加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。培养基配方牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水pH数量0.75g1.5g0.75g3g150mL7.610实验程序2（培养基的配制方法和步骤）3.调pH值：用10％NaOH调pH至7.6，用精密pH试纸对照。4.分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意不要污染棉塞和瓶口。5.包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。6.灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。11实验程序2（培养基的分装和斜面培养基的制作）☆每支试管装的量为试管高度的1/4～1/3.☆斜面长度为试管长度的1/3～1/2.12实验程序2（培养基的配制方法和步骤）13实验程序3（无菌稀释水的制备）取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。另取5支18mm×180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。14实验程序4（培养基和玻璃器材等的灭菌）加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌的操作方法a.将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160℃并维持2h；b.把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50℃左右，才能将物品取出。15实验程序4（培养基和玻璃器材等的灭菌）湿热灭菌：高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：1.灭菌锅内加入一定量的水。2.将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。3.接通电源，进行加热。4.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。16实验程序4（培养基和玻璃器材等的灭菌）5.当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为121℃)即开始灭菌，使其维持15～30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2)，延长时间。6.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。7.待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。1718实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。操作方法：a.待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，连续3d重复进行。b.在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37℃恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。c.第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。19实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。20第二部分细菌纯种分离、培养和接种技术目的要求实验材料实验程序21目的要求掌握从环境中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。掌握几种接种技术。22实验材料无菌培养皿(直径90mm)10套、无菌移液管1mL2支、10mL1支。营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。23实验程序细菌的纯种分离细菌的接种方法24实验程序1（细菌的纯种分离）稀释平板法平板划线法25实验程序1（细菌的纯种分离——稀释平板法）1.取样。2.将1瓶90mL和5管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样(或其它样品)加入编号为10－1无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10－1浓度的菌液。用1mL无菌移液管吸取1mL10－1浓度的菌液于编号为10－2无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10－6。26实验程序1（细菌的纯种分离——稀释平板法）稀释液的制备27实验程序1（细菌的纯种分离——稀释平板法）3.平板的制作①取10套无菌培养皿编号，10－4、10－5、10－6各3个，另一个为空气对照。②取1支1mL无菌移液管从浓度小的菌液开始，以10－6、10－5、10－4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。28实验程序1（细菌的纯种分离——稀释平板法）3.平板的制作③加热培养基，当其冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。29实验程序1（细菌的纯种分离——稀释平板法）3.平板的制作④取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上，倒置于30℃培养24～48h，然后观察结果。30实验程序1（细菌的纯种分离——平板划线法）1.平板制作：将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。2.划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)。划线完毕盖好皿盖，30℃培养24～48h后观察结果。31实验程序1（细菌的纯种分离——平板划线法）32实验程序2（细菌的接种技术）接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。图－633实验程序2（细菌的接种技术——斜面接种法）①左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面(两支试管的斜面同时向上)。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。②右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。③将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。12334实验程序2（细菌的接种技术——斜面接种法）④将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。4567835实验程序2（细菌的接种技术——液体接种和穿刺接种）液体接种法(从斜面菌种接入培养液)：用接种环挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。穿刺接种法(从斜面菌种接入(半)固体培养基)：用接种针经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。36实验程序2（细菌的接种技术——稀释平板涂布法）稀释样品：方法同稀释平板分离法倒平板：将融化并冷至50℃左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。37实验程序2（细菌的接种技术）液体培养基中的菌种接入液体培养基中接种工具：无菌移液管和无菌滴管移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。38实验二结束