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实验十一组织培养与病毒的细胞感染法•练习内容•1．鸡胚纤维母细胞培养法（示教）•2．病毒的空斑形成试验（示教）•3．致细胞病变作用的观察（示教）目的要求•1．了解细胞培养的原理与方法•2．了解病毒空斑形成试验方法与意义•3．了解病毒对细胞致病变作用的类型。•一、单层细胞培养法•（一）鸡胚纤维母细胞培养法•（二）人胚肾细胞培养法•二、人双倍体细胞培养法双倍体细胞株，是一种能在体外分裂50代左右而—直保持其双倍染色体的单层细胞，人双倍体细胞来源可以是人胚肺（4个月以内的胎儿）或人胚肾•三、传代细胞培养法传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双倍体细胞转化而来，实验室常用从人瘤细胞建立起来的传代细胞如Hela细胞，KB细胞、HEP—2细胞已广泛地应用于病毒实验。这些传代细胞系的最大特点是通过规律地间隔传代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮四、器官培养•五、病毒的细胞感染法在单层细胞上测定病毒的方法有多种，常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑形成抑制试验.六、细胞致病作用的观察细胞致病作用也称“细胞病变作用”（Cytopathic-effect，CPE），根据病毒和感染细胞的不同，细胞病变作用大致上可以分不同三个类型。•（一）全变型•指整个细胞都发生改变，常表现为（1）细胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变性、胞膜边缘不整齐，或（2）整个细胞发生碎裂、皱缩、变圆、脱落。•（二）包涵体型•有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体（见表13—3）。•（三）融合型•有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等）可使多数病变细胞间相互发生融合而呈“巨细胞”（但各个细胞的胞核仍可分辨）。•【结果观察】•纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变程度：•（－）—无细胞病变；•（+）—25％以下的细胞有病变作用；•（++）一50％的细胞有病变作用；•（+++）一75％左右的细胞有病变作用；•（++++）一75％以上的细胞有病变作用；•某些病毒引起细胞病变的主要特征(表13—2)实验十四病毒的血清学试验•血清学试验的方法很多，一股实验室最常用的是中和试验，补体结合试验和红细胞凝集及凝集抑制试验。近年来免疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接红细胞凝集试验、琼脂扩散试验以及红细胞吸附抑制试验等技术，也成为实验室病毒诊断的常规技术。•练习内容•1．病毒的血球凝集试验•2．病毒的血球撬集抑制试验•目的要求•1．了解病毒的血清学试验方法与原理•2．掌握病毒的血凝试验和血抑试验的方法与结果判读•血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的基本方法之一。三、病毒的血球凝集与血球凝集抑制试验•某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，见表玉14一4。当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点.这里我们以新鸡城瘟病毒NDV为例介绍血凝和血凝抑制试验。•【材料】•新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液1份•0.5％鸡血球悬液1管•生理盐水或PBS1瓶•96孔微量血清盘1块•微量稀释棒1支•无菌试管1支•【方法】•1．在微量血清盘的末孔标记为对照孔。•2．各孔中加生理盐水25微升。•3．取病毒鸡胚尿囊液（经离心）0.1毫升加入无菌试管，然后加生理盐水0.9毫升（即1∶10稀释）。•4．取1∶10病毒稀释液25微升加入第1孔，再吸25微升置2孔，用微量稀释棒捻转20次……依次稀释，直至第9孔弃去25微升。•5．各孔中加0.5％鸡红血球25微升充分摇匀。•6．置室温经30分钟，40分钟，1小时各观察一次结果。以45分钟为准。新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺序(表14-5)2525252525252525孔列12345678910病毒稀释度1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶12801∶2560对照生理盐水（μl）25251∶10病毒悬液（μl）252525252525252525—弃去250.5%鸡红血球（μl）25252525252525252525摇匀后，置室温静止30—50分钟•【结果判读】•各孔出现的血球凝集程度以+++、+++、++、++、+、—表示。•++++为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底；•+++约有50％血球发生凝集；•++约有50％血球发生凝集；•+约有25％血球发生凝集；•—不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小点，边缘光滑，圆润。•血凝试验的结果以50％血球凝集（++）的最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即为1个血凝单位。血球凝集抑制试验•【材料】•除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。•【方法】•1．血凝素单位的配制和调配•2．住微量血清盘上编号，并设血清对照、病毒（血凝集）对照和血球对照孔．然后2—11孔中各加生理盐水或PBS25微升。．•3．将1∶10血清加入1、2、9孔，并从第2孔起作一系列倍比稀释至1∶1280或更高的稀释度，每孔为25微升。•4．按操作简表加入4单位血凝集。••6．混匀，在室温下作用20分钟。•7．各孔中滴加0.596鸡血血球悬液50微升。8．在血清对照、病毒（血凝素）对照，血球对照孔中滴加生理盐水或PBS各25微升。•9．混匀后，在室温下静止，30分钟，60分钟各观察一次结果。一般以60分钟结果为准，但如果血球下滑显著，则以30分钟结果判读。252525252525251234567891011血清稀释度1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶1280血清对照病毒对照血球对照生理盐水（μl）NS2550稀释的血清（μl）252525252525252525弃去——4单位血凝（μl）2525252525252525—25—摇匀后，置室温静止30—50分钟0.5%鸡红血球（μl）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5•1．根据各孔血球凝集程度，以“++++、+++、++、+，－”表示。•2．查看各对照孔：血清对照不凝集（－）：病毒对照为完全凝集（++++），血球对照则应不凝集（—）。•3．以出现完全抑制血球凝集（即不凝集）的最高血清稀释度为其最终滴度。例如•稀释倍数：1∶10l∶201∶40l∶801∶1601∶320l∶6401∶1280•结果：－－－－－+++++++++•此血清血凝抑制滴度为1∶160，结果判读】实验十五病毒的快速诊断•目的要求•1．初步掌握电镜下病毒的基本形态•2．了解ELISA的原理、方法及结果判读•练习••ELISA酶联免疫吸附试验•（EnzymeLinkedimmunosorbentassay，ELISA）•ELISA是当前各实验检测抗原抗体最常用的方法之一，也是进行病毒快速诊断的重要手段。它具有灵敏度高（10－9一10－12克），特异性强、操作简便、易于观察、便于现场大规模检查。•ELISA的种类有许多种，但用于病毒快速诊断常用间接法和双抗体夹心法（一）间接法（indirectmethod）•1．抗原包被纯化抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液适当稀释后，在微量凹孔板上，每孔加100微升，置湿盒中4℃过液，洗涤三次。•2．加待捡血清每孔加100微升适当稀释的待检血清，置湿盒中，37℃2小时。洗涤三次。•3．加酶结合物每孔加100微升酶标记抗人Ig，置湿盒中，37℃2小时。洗涤三次。•4．加底物每孔加底物100微升，置湿盒，37℃30分钟。•6．加终止液100微升。•6．读取结果。（二）双抗体夹心法（Doubleantibodysandwichmethod）•1．抗体包被已知抗体用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至1—10微克／毫升，在微量凹孔板上，每孔加100微升包被，置湿盒4℃过夜。洗涤三次。•2．加待检标本每孔中加含抗原的待检标本100微升置湿盒37℃小时。洗涤三次。•3．加酶结合物每孔加酶标记的特异性抗体100微升置湿盒37℃小时。洗涤三次。•4．加底物•5．加终止液•6．读取结果•【结果判读】•用酶标测定仪测在492nm下各标本光密度OD值。•ELISA的结果易受到各种因素影响，因此每次试验（每一块试验板）都设阳性对照，阴性对照、稀释液对照、阳性对照OD值≥1.0，阴性对照OD值≤0.2，结果用P／N值表示。•P/N值1.5-2.1者为可疑•P／N值1.5为阴性P／N值≥2.1者为阳性