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枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验一、实验原理以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。二、实验材料（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（二）培养基：1、种子培养液：葡萄糖1%、胰蛋白胨：1%,、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2，若配置固体培养基，则再加入1.5%琼脂。2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉2.0%、蛋白胨1.5%、CaCl20.02%、MgSO40.02%、NaCl0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%、Na2HPO40.2%调节pH值7.0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管三、实验过程1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。2、种子斜面及种子液准备A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（100KPa20min）。C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃120r／min振荡培养16h作种子液。（6瓶/组）3、发酵培养A、按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。B、在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。40-48h酶活降低后结束实验。4、发酵结束后，用显微镜检查是否染菌。5、待测酶液的制备：称取1g~2g酶粉(精确至0.0001g)或准确吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4u/mL~4.5u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。6、酶活力的测定吸取10.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液2.5mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂置于70℃±0.2℃)恒温水浴中预热8min；加入0.5mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5min；立即用移液管吸取1.0mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1，求得测试酶液的浓度。7、酶活力计算（1）中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算:X1=c×n式中:X1—样品的酶活力，u/mL或u/gc—测试酶样浓度，u/mL或u/gn—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入固定化酶的量来控制）。注：所得结果表示至整数。允许差：平行试验相对误差不得超过5%（2）耐高温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算:X2=c×n×16.67式中:X2—样品的酶活力，u/mL或u/gc—测试酶样浓度，u/mL或u/gn—样品的稀释倍数16.67—根据酶活力定义计算的换算系数。注：所得结果表示至整数。允许差：平行试验相对误差不得超过5%