搜索
基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和第四章基因组测序§4.1基因组测序的方法§4.2DNA顺序的组装§4.3基因组测序的其他路线§4.4人类基因组测序与组装基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和§4基因组测序§4.1基因组测序的方法DNA测序是在核酸酶学和生物化学的基础上，创立并发展起来的一门重要的DNA技术学。这门技术对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片段的操作方面，都具有十分重要的实用价值。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和DNA测序的两种方法：链终止法（thechainterminationmethod）单链DNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的酶促合成来判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。化学降解法（chemicaldegradationmethod）双链DNA分子被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被切开，从而确定DNA分子的序列。§4基因组测序§4.1基因组测序的方法基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和Sanger双脱氧链终止DNA测序法：利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。1980年诺贝尔奖金获得者F.SangerSanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理：•聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。•利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列在每一反应试管中，都加入一种互不相同的ddNTP和全部4种dNTP，其中ddNTP带有32P同位素标记。反应混合物样品加在聚丙烯酰胺凝胶中，按片段大小进行电泳分离。谱带的判读是从胶的底部开始，所得的核苷酸碱基顺序，与模板链为互补链。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和链终止法对DNA多聚酶的要求高酶活性保证不会反应提前终止无5’→3’外切酶活性保证不切除新合成链的5’端，改变链长度，给读序造成误差无3’→5’外切酶活性保证不切除新合成链的3’端，改变链长度，给读序造成误差测序的DNA多聚酶目前普遍采用的测序酶为Sequenase,来自T7噬菌体基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和将DNA克隆到质粒载体这种方法是获得测序模板DNA最常用的方法。获得的DNA通过热变性或者碱变性转变为单链DNA进行测序。优点：可双向测序。缺点：样品可能有少量细菌的DNA或者RNA污染，会干扰测序。链终止反应要求单链作为模板如何得到单链DNA？基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和将DNA克隆到M13噬菌体载体M13噬菌体载体是专为得到单链DNA测序模板而设计的。M13噬菌体本来含有单链DNA基因组，感染大肠杆菌的M13可转变为双链复制型。M13噬菌体载体是双链的，相当于M13噬菌体的复制型。用含有待测序片段的M13噬菌体载体感染大肠杆菌，大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链DNA基因组。缺点：只能用于短片段DNA，大于3kb的片段在克隆过程中会发生缺失和重排。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和将DNA克隆到噬粒这是一种改造过的质粒克隆载体，含有两个复制起点，一个是质粒自身的复制起点，一个是单链DNA噬菌体基因组的复制起点，当大肠杆菌细胞中同时含有噬粒和辅助噬菌体时，因为辅助噬菌体携带的编码噬菌体复制酶和衣壳蛋白的基因可以激活噬菌体DNA的复制产生含单链的噬粒噬菌体。优点：克隆片段可达10kb以上。PCR产生单链DNA引物决定模板链的测序起点基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和Maxam-Gilbert化学降解法：化学修饰DNA测序法，是美国哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert于1977年发明的。化学降解法主要用于测定短片段DNA的序列。Maxam-Gilbert化学降解法的原理：用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和碱基特异的化学切割反应碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序化学法测序基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和化学修饰法的测序过程（a）利用32P标记DNA片段的末端；（b）将32P末端标记的DNA片段分成4个反应管，进行化学切割反应；（c）在聚丙烯酰胺测序胶上电泳，经放射自显影，根据带谱可读出相应的序列。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指“读片过程”的自动化。自动化的DNA序列分析，也是根据Sanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。高通量自动化测序自动化测序原理自动化测序类似于PCR反应，但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的ddNTP与4种dNTP。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。优点：可用双链DNA做模板；模板用量少，不必克隆；可实现高通量自动化。高速自动DNA测序仪的结构及工作原理由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统后被导向凝胶表面的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，同经过检测孔的DNA片段发生作用，并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光通过聚焦镜集中后传给滤光镜/棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别开来。经成像透像最后由高灵敏度的相机分段收集信号，传送给计算所分析处理。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和以荧光化合物标记双脱氧核苷酸的自动测序荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和毛细管电泳DNA自动化测序用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，可使DNA的测序速度更为迅速。这种电泳装置有96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应。自动化测序的改进基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和毛细管电泳测序装置：DNA样品通过一束充满凝胶的毛细管进行电泳，利用共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号放大，并由计算机读取碱基顺序。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：手工测序：最大约300bp；自动测序：最大约1200b。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和LI-COR4300DNA遗传分析系统LI-COR4300DNA遗传分析系统单向测序能力可达1.2kb，测序准确率99%，是目前测序长度最长、准确性最高的测序仪。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和又叫焦磷酸测序。链合成反应体系中没有ddNTP，各种dNTP分别加入，当dNTP连接到DNA3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列。非常规DNA测序光点测序（pyrosequencing)基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和光点测序原理图示基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和DNA芯片测序基本原理：将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.缺点：每次测序的长度受寡核苷酸数目的限制。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和1ATACGTTA2GTTAGATC3ACGTTAGA4CGTTAGAT5GTTAGATCDNA样品TATGCAATCTAG与基因芯片上65,000种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1ATACGTTA3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT5GTTAGATC3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和第三代DNA测序技术新突破——单分子DNA纳米孔测序技术来自美国华盛顿大学等处的研究人员利用纳米生物学技术获得了新一代测序技术的突破，这种新方法能为癌症、糖尿病或某些成瘾患者量身绘制个性化基因测序蓝图，提供更加高效的个体医疗。这一研究成果公布在PNAS杂志上。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和领导这一研究的是华盛顿大学的JensH.Gundlach，其它研究人员包括：IanDerrington,TomButler,ElizabethManrao和MarcusCollins等人。接二连三的个人基因组图谱绘制陆续完成，说明了第二代测序技术的强大力量，但是第二代测序技术很快就遇上了强劲的对手——第三代测序技术，也就是被称为下下一代的测序（next-next-generationsequencing）的直接测序方法。这一测序技术是基于纳米孔（nanopore）的单分子读取技术，不同于之前的两代技术（需要荧光或者化学发光物质的协助下,通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的），可以直接读取序列信息，简洁快速。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和第一代测序技术是双脱氧链末端终止法——根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。第二代测序技术是焦磷酸测序法——由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析。而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。这一技术的研发是系统工程，涉及生物、半导体、计算机、化学、光学等多个领域，需要不同学科顶尖力量的合作。基因组学杭州师范大学生命与环境科学学院向太和在这篇文章中，研究人员设计了一种可以在纳米孔内对DNA进行快速测序的新方法，这种纳米微孔只有1个纳米大小，仅够用来测量一个DNA的单分子链。研究人员把微孔放在一层浸泡在氯化钾溶液中的膜上，并施加一个小的电压，让电流通过微孔。不同的核苷酸通过纳米微孔时，回路中的电流就会随之改变，这些电流称为特征信号。胞核嘧啶、鸟嘌呤、