基因编辑

基因编辑(geneediting)2016.05基因编辑热度变化趋势200520092007201120132015基因编辑---knockoutdsRNA干扰---knockdown娱乐圈的偶像王力宏也发微博力挺基因编辑的热门技术——CRISPR/Cas9，似乎为基因编辑做了免费“代言”.小撒与章子怡的恋情正是因为两者没有共同话题语言（法律、娱乐）。•基因编辑的定义：通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。•第一代:ZFN(锌指核酸酶)，1996年；•第二代:TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)，2011年；•第三代:CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)，2013年；•第四代：NgAgo-gDNA，韩春雨，2016；基因编辑被喻为“豪华版诺贝尔奖”第一代技术:锌指核酸酶Zinc-fingernucleases（ZFN）ZFN组成ZFN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys-His锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶FokI：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。锌指蛋白ZFN的工作原理ZFN成对的时候才发挥功能二代：TALEN技术原理与演进TALEN=DNA识别域+核酸内切酶TALEN组成TALEN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列TALE蛋白串联组成（20个左右），每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNAFokIFokITALEN介导的基因编辑原理一对特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂；再通过同源重组引入新基因、通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。三代：CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9系统组成CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者的基因武器）：•CRISPR序列（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回文重复（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatSequences）。•Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR/cas系统的发现•1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。•随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端，有多组DNA序列+反向序列+约30bp空格序列（spacerDNA），组成成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被称为CRISPR。•2005年提出假说：3个生物信息学课题组报道，CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序列互补匹配。假说：细菌CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机制相关，细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结合，起到类似RNA干扰的作用。•2007年实验验证：Danisco公司的Barrangou和Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸菌）中几个CRISPR序列的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力（Science,2007）。•德国学者机制研究：Helmholtz、Doudna和、Charpentier分别对不同的CRISPR及相关系统进行了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。CRISPR-Cas9=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：向导RNA，由两部分组成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(transactingCRISPRRNA,tracrRNA)。crRNA一端与靶标核苷酸互补结合，另一端与tracrRNA互补结合。核酸内切酶：Cas9核酸内切酶。CRISPR/Cas原理Cas9CRISPR-Cas9的工作原理三代主流技术对比：12008004000CRISPR的科研论文在2014和2015两年有了明显的增长,ZFN和TALEN领域增长较缓。20092011201020122013201420152016美国中国日本德国英国韩国丹麦法国新加坡加拿大美国日本中国德国韩国法国英国中国香港荷兰意大利美国德国中国日本英国法国加拿大荷兰丹麦韩国从以上数据看出：•CRISPR/Cas9是目前生物学领域最炙手可热的工具之一。•中国在三大主流技术的科研论文数量在全球国家排名中都位列前三，但与美国的差距还很大，在CRISPR领域的论文不到美国的一半，但比其他国家都多。第四代：NgAgo-gDNA技术文章的发表（CNS）2016年5月2日，河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在被《Science》审稿小半年后被拒，历时9个月终被《NatureBiotechnology》（IF=42）接收并发表。韩春雨（中）、沈啸（左）、高峰（右）NgAgo-gDNA的优势1、向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成短单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。由于向导核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。2、可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没有限制，对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。3、“Cas9的“取材”范围有限，NgAgo的优势之一，就是大大扩充了基因编辑的取材范围。”韩春雨在接受媒体采访时表示，“在新技术帮助下，地球上大部分生物的基因都可成为基因编辑工具，这意味着基因编辑技术受限更小，便利性更大”。4、新的基因编辑工具精确性更高，脱靶率更低。李伟介绍，NgAgo要结合24个碱基，比Cas9结合的19个碱基要长5个碱基，理论上其精确性会提高1024倍。5、韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacteriumgregoryi）的Argonaute蛋白实现了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶，适合在人体细胞（37°）中进行基因组编辑。NgAgo-gDNA的优势同行评价•《自然》杂志执行主编尼克·坎贝尔评论说：“虽然这项新技术还处于初期，但有一些理由让我们相信它与现在普遍使用的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术相比有多种优势，特别是在更精准的基因编辑方面。”•“韩春雨的工作是国际一流的技术推进，”北京大学理学部主任、生物学家饶毅教授如此评论。他担任主编的科学类新媒体《知识分子》刊文，介绍了这项成果的学术细节和价值。•“做研究主要还是靠人，设备环境只是第二位的。”韩春雨对记者表示：“我认为青年科研人员不要抱怨环境，而是要争取环境，做自己喜欢的研究，就自然能等到结出成果的那一天”。•“在一所不太有名的大学，我们自己培养出的科研人员也能做出这样的成果，能够和美国的最新技术叫板，是一件了不起的事情，”鲁白评价说。•非名校(非985非211的河北科技大学)、非名人(名不见经传，几乎没有任何人才头衔称号)、无职位(无行政职位)的“三无”副教授韩春雨因为一篇新发表的论文“一鸣惊人”，甚至有业内人士分析称其未来有可能获得诺贝尔奖。同行评价毕业后至今13年的主要成果是2篇中文文章发展“钱景”相当广阔比尔·盖茨甚至曾经预言：超过我的下一个世界首富必定出自基因领域。基因编辑技术创造生命奇迹，美国基因编辑龙头接连上市。2016-05-16在不到一周的时间里，美国农业部相继豁免了一种基因编辑蘑菇和一种基因编辑玉米的监管。多酚氧化酶期盼闽师学子时间都去哪了？？？