基因编辑CRISPER CAS9

CRISPR/Cas9基因组编辑的研究进展学科教学（生物）王菲1611290055要点▷『基因编辑技术』▷『CRISPR/Cas的研究进程』▷『CRISPR/Cas的结构、分类及作用机制』▷『CRISPR/Cas在基因治疗中的应用』▷『存在问题和展望』第一部分『基因编辑技术』基因编辑技术12016年5月2日河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》发表论文《NgAgo-DNA单链引导的基因编辑工具》。基因编辑技术1基因编辑技术是通过人为操作引起特定基因的插入、缺失或替换等，对基因组进行精确修饰和定向编辑的一种技术。▷①Cre-LoxP重组酶系统：Cre重组酶是一种具有催化活性的单体蛋白,它与限制酶功能相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。基因编辑技术1▷②RNA干扰：大片段双链RNA小分子干扰RNA二聚体酶DicerRNA+沉默诱导复合体RISC配对影响翻译基因编辑技术1▷锌指核酸酶（ZFNs）▷转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）基于特制的DNA-结合特异性的蛋白质系统，通过束缚核酸内切酶的催化区域，调节DNA结合蛋白，引起特定位点的靶向双链DNA断链。③人工内切核酸酶技术ZFNsTALENs将识别特异DNA序列的TALEN与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALENs基因编辑技术1▷规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas）：通过一小段与靶向DNA碱基互补配对的RNAs及其引导Cas蛋白，引起DNA位点特异性靶向双链DNA断链，产生靶基因修饰。③人工内切核酸酶技术第二部分『研究进程』CRISPR/Cas的研究进程21987年2000年2002年日本Ishino在大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近第一次发现CRISPR串联重复序列。Mojica发现这种串联重复序列在原核细胞中广泛存在。科学家正式命名CRISPR和Cas基因。2005年发现CRISPR中的间隔序列来源于外源基因，并推测其可能与细菌和古生菌的获得性免疫相关。CRISPR/Cas的研究进程22007年2008年2009年Barrangou首次实验证实CRISPR系统的获得性免疫作用。Brouns发现间隔序列可以转录形成crRNAs，具有指导Cas蛋白靶向干扰的作用。Marraffini发现CRISPR/Cas系统系统的作用靶点是DNA。Hale发现III型B亚型的CRISPR-Cas系统还可以靶向性切割RNA。2011年Deltcheva发现II型CRISPR-Cas系统中另一个重要组分tracrRNA，它与crRNA结合形成二元复合体，指导Cas9蛋白的定点剪切。Sapranauskas证实II型CRISPR-Cas系统可以异源性地表达在其它物种。CRISPR/Cas的研究进程22012年2013年2014年珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰首次体外证实Cas9蛋白可以与靶DNA特定位点结合并行使剪切作用。获2015年生命科学突破奖。CRISPR-Cas系统首次被成功应用于真核细胞的基因编辑。解析Cas9蛋白的晶体结构。2015年全新基因编辑系统CRISPR/Cpf1。CRISPR/Cas的研究进程22016年12月CRISPR/Cas重大进展梳理1.Nature：发现两种新的CRISPR系统：CasX和CasY系统2.Cell：首次发现CRISPR/Cas9基因编辑的“关闭开关”3.Cell：发现两种新的抗CRISPR蛋白：AcrIIA2和AcrIIA4，能阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性4.NatGenet：利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标5.Science：利用CRISPRi鉴定出细胞生长所需的499个lncRNA6.NatMethods：开发出自我编辑的CRISPR条形码7.Cell：将CRISPR和单细胞RNA测序结合在一起分析基因功能……第三部分『CRISPR/Cas结构、分类及作用机制』CRISPR/Cas的结构3CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats），被称为规律成簇间隔短回文重复序列，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。CRISPR/Cas的结构3Cas基因主要编码核酸酶和DNA解旋酶等切割修饰核酸的相关的Cas蛋白。前导序列保守的重复序列区长度为21～48bp含有回文序列，可形成发夹结构。间隔区由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆。富含AT长度为300～500bpCRISPR/Cas的分类3间隔区俘获外援DNACRISPR/Cas的分类3CRISPR/Cas9的作用机制3PAM：（protospaceradjacentmotif）间隔相邻基序，该序列由NGG3个碱基组成，位于DNA结合区域上游并且紧邻结合区域处。帮助crRNA识别和获取靶位点片段;在干扰过程中帮助该核糖核蛋白复合物区分自身的DNA和外援入侵的DNA。CRISPR/Cas9的作用机制3PAM：（protospaceradjacentmotif）间隔相邻基序，该序列由NGG3个碱基组成，位于DNA结合区域上游并且紧邻结合区域处。CRISPR/Cas9的作用机制3tracrRNA：(反式激活CRISPRRNA)与CRISPR重复序列互补的一段25bp的核酸序列pre-crRNA：整合后的间隔序列首先被转录为CRISPR前体RNAcrRNA：pre-crRNA在RNaseⅢ作用下进一步加工形成成熟的CRISPR源性小RNACRISPR/Cas9的作用机制3将crRNA与部分tracrRNA融合成一条约100bp的单链向导链(singleguideRNA，sgRNA)，使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性，并且在随后的实验中发现，sgRNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。由于靶位点与gRNA特异互补的区域最多只有20nt长度因此，在设计gRNA结合区域时也只能在20bp的长度内。sgRNACRISPR/Cas9的作用机制3Cas9核酸酶中存在一种晶体结构识别瓣叶（REC）：核酸酶瓣叶（NUC）HNHRuvCPAM区域（5'-GG-N18-NGG-3'）RuvC：Cas9氨基末端，剪切crRNA非互补链。HNH：Cas9蛋白质中部，剪切crRNA的互补DNA链。识别并结合gRNA和目标DNA的复合体。CRISPR/Cas的作用机制3将CRISPR/Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：①Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段；②导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。CRISPR/Cas9的作用机制3CRISPR系统介导的免疫机制的3个阶段①新的间隔序列的获取；②CRISPR/Cas系统的表达，包括转录和转录后的加工；③CRISPR/Cas系统对外源基因的干扰。3易错配的非同源性末端连接高保真性的同源重组修复先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，再用新合成的序列补上母链空缺。CRISPR/Cas9对DNA损伤的修复为了避免DNA或染色体断裂的滞留，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。第四部分『在基因治疗中的应用』CRISPR/Cas在基因治疗中的应用4①对于功能缺失型突变引起的基因遗传病，可利用CRISPR/Cas9将功能基因片段插入，改正引起疾病的突变体;②对于显性基因遗传病，可利用CRISPR/Cas9引起NHEJ使显性致病基因切除;③对于基因重复复制所引起的疾病，CRISPR/Cas9用多个sgRNA同时引起多个DSB切除重复区域。CRISPR/Cas9也可直接用于体细胞定向基因编辑，将细胞在体外进行定向编辑，再融入患者体内，定向修饰基因。CRISPR/Cas9在HIV-1病毒治疗中的应用4HIV-1基因的表达由长末端重复序列(LTR)启动子和增强子活性调控。构建敲除LTR的CRISPR/Cas9系统破坏HIV-1基因组中长末端重复序列(LTR)启动子，从而大大地降低了HIV-1在感染细胞内的表达。利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标4利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选，研究人员描述了如何利用CRISPR筛选HIV感染但不是细胞存活所必需的人基因的方法鉴定出5个基因。当让它们失活时，会让细胞免受HIV感染，同时不会影响细胞存活。除了CD4和CCR5之外，这种筛选方法鉴定出编码两种酶的基因---TPST2和SLC35B2：它们对CCR5进行修饰以便HIV结合。另一个被鉴定出的基因是ALCAM，它参与细胞间粘附。当CD4阳性T细胞接触低水平HIV病毒时，ALCAM缺失与显著地抵抗HIV感染相关联。CRISPR/Cas9与iPS技术共同用于基因治疗4DNA甲基转移酶3B(DNA-Methyltransferase3B，DNMT3B)基因突变引起免疫缺陷，着丝粒不稳定，面部异常综合征(ICF)。Cas9载体＋定向打靶DNMT3B基因的sgRNA载体诱导性多能干细胞(iPS)细胞成功破坏DNMT3B等位基因的iPS细胞共转染CRISPR/Cas9移除β细胞中的HAT酶增加胰岛素产生4组蛋白乙酰转移酶（HAT）在调节基因TXNIP中发挥着至关重要的作用。在高血糖水平情形下，TXNIP导致β细胞死亡，并且降低胰岛素产生。研究人员对来自2型糖尿病患者和来自健康人的产生胰岛素的胰岛进行比较，结果发现糖尿病β细胞中的HAT基因活性比健康β细胞高出2倍。利用CRISPR/Cas9，瑞典隆德大学糖尿病中心的研究人员移除遗传密码中控制来自大鼠的产生胰岛素的细胞中的HAT酶功能的序列。这导致TXNIP基因活性下降，因而降低细胞死亡和增加胰岛素产生。第五部分『存在问题和展望』CRISPR/Cas脱靶效应及改进方法5脱靶效应是由于Cas9蛋白可容忍sgRNA和靶向DNA在5'端的错配。Cas9进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶。①降低Cas9和sgRNA在细胞内的表达浓度②减少sgRNA5'端的互补序列，与没有减短的sgRNA打靶活性相同，但大大降低了脱靶位点引起的突变效应，同时提高了sgRNA∶DNA错配的敏感性，从而降低突变效应。③改造Cas9蛋白结构。Cas9突变体Cas9n切口酶切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径(base-excisionrepair，BER)修复，不会在基因DNA上造成突变。通过两个Cas9n产生两个单链DNA断裂(single-strandbreak，SSB)或在不同DNA链上产生缺口以造成双链DNA断裂的策略，可有效避免脱靶突变。CRISPR/Cas脱靶效应及改进方法5脱氨基反应形成去嘧啶位点（AP位点）糖苷水解酶能特异性切除受损核苷酸的N-β糖苷键AP核酸内切酶切开受损核苷酸的糖苷-磷酸键，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNACRISPR/Cas的安全隐患5①借助病毒载体把编码Cas9的DNA带入细胞。在Cas9完成切割任务之后细胞仍会继续生产这种蛋白，机体可能会对其产生免疫反应。②基因编辑的细胞会死亡，患者需要进行多次治疗。③基因导入和编辑途径都会受病毒载体可携带DNA量的限制。目前必须使用两种不同的病毒载体将CRISPR组件导入到细胞中，这比使用单个载体效率更低。CRISPR/Cpf152015年9月，张锋等又找到了一种新型的CRISPR系统——CRISPR/Cpf1，与Cas9相比，Cpf1有以下三大优势：①Cpf1剪切DNA只需要一个小RNA分子，Cpf1酶比标准的SpCas9要小，更容易进入组织和细胞。②Cpf1剪切后形成两个不同长度的链，粘性末端让DNA插入更可控。③Cpf1剪切时离识别位点很远，在编辑位置的选择上有了更多的选项。CRISPR/Cpf15CRISPR/Cpf1系统能够克服Cas9靶向多个基因位点的限制。研究表明，Cp